LDN-57444 DUB remmer

Behandeling met 50 μM LDN-57444 gedurende 24 uur leidt tot 70% remming van de proteasoomactiviteit. Deze verbinding veroorzaakt een significante en concentratieafhankelijke afname van de cellevensvatbaarheid bij concentraties boven 25 μM en de cellevensvatbaarheid daalde tot 61,81% bij 50 μM. Het is in staat om celdood via de apoptoseroute te veroorzaken door de activiteit van het ubiquitine-proteasoom-systeem te verlagen en de niveaus van sterk geübiquitineerde eiwitten te verhogen, die beide de ongevouwen eiwitrespons kunnen activeren. De apoptose geïnduceerd door deze chemische stof kan worden geactiveerd door de activering van endoplasmatisch reticulum stress (ERS). [4]

HTS-screening

Om een assay te starten, wordt 0,5 μL van 5 mg/mL testverbinding (ongeveer 50 μM uiteindelijke reactieconcentratie) of DMSO-controle gealiquoteerd in elk putje. Zowel enzym als substraat worden bereid in UCH-reactiebuffer (50 mM Tris-HCl [pH 7,6], 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT en 0,5 mg/mL ovalbumine). Vervolgens wordt 25 μL van 0,6 nM UCH-L1 aan elk putje toegevoegd, behalve aan de substraatcontroleputjes, gevolgd door 45-60 s schudden van de plaat op een automatische schudder. Het enzym/verbindingmengsel wordt 30 min bij kamertemperatuur geïncubeerd voordat 25 μL van 200 nM Ub-AMC wordt toegevoegd om de enzymreactie te initiëren. Het reactiemengsel (300 pM UCH-L1, 100 nM Ubiquitine-AMC met 2,5 μg testverbinding) wordt nog eens 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd voordat de reactie wordt geblust door de toevoeging van 10 μL 500 mM azijnzuur per putje. De fluorescentie-emissie-intensiteit wordt gemeten op een LJL Analyst met behulp van een coumarinefilterset (ex = 365 nm, em = 450 nm) en wordt afgetrokken van de intrinsieke fluorescentie van de verbinding om de enzymactiviteit te onthullen. Een DMSO-controle (0,5 μL DMSO, 25 μL UCH-L1, 25 μL ubiquitine-AMC, 10 μL azijnzuur), enzymcontrole (25 μL UCH-L1, 25 μL buffer, 10 μL azijnzuur), substraatcontrole (25 μL buffer, 25 μL ubiquitine-AMC, 10 μL azijnzuur) en remmercontrole (0,5 μL ubiquitine-aldehyde [100 nM stock], 25 μL UCH-L1, 25 μL ubiquitine-AMC, 10 μL azijnzuur) worden ook uitgevoerd in elke assayplaat om kwaliteit en reproduceerbaarheid te waarborgen. Potentiële UCH-L1-remmers worden geselecteerd als de verbindingen een remming van meer dan 60% aantoonden in vergelijking met de controles. De enzymatische UCH-L1-reacties worden handmatig twee keer herhaald met hetzelfde protocol om de resultaten voor de hitverbindingen van de primaire robotgestuurde screening te bevestigen.

LDN-57444 veroorzaakt in vivo dramatische veranderingen in de synaptische eiwitdistributie en wervelmorfologie. Behandeling met deze verbinding resulteert ook in een snelle daling van Uch-L1-activiteit, maar proteasoomremming heeft geen effect op cAMP-niveaus over een periode van enkele uren. [3]