TAK-285 EGFR remmer

Van de 34 geteste kinasen remt TAK-285 alleen HER4 significant met een IC50 van 260 nM, remt het licht MEK1, MEK5, c-Met, Aurora B, Lck, CSK en Lyn B met een IC50 van respectievelijk 1,1 μM, 5,7 μM, 4,2 μM, 1,7 μM, 2,4 μM, 4,7 μM en 5,2 μM, en vertoont het geen activiteit tegen andere kinasen met een IC50 van >10 μM. Deze verbinding vertoont significante groeiremmende activiteit tegen BT-474 cellen (HER2-overexpresserende menselijke borstkankercellijn) met een GI50 van 17 nM. [1] Vergeleken met SYR127063, een krachtige remmer van HER2, vertoont het een vergelijkbare in vitro potentie tegen HER2 en EGFR. Vergeleken met de volledige cytoplasmatische domeinen van de wild-type eiwitten, veranderen de mutaties en verkorte grenzen die worden gebruikt voor structuurbepaling van HER2-KD en EGFR-KD de remmende activiteit (IC50) van deze chemische stof niet significant. Het bindt aan de inactieve conformatie van EGFR en vertoont een vergelijkbaar bindingsmechanisme met lapatinib in de actieve site. [2]

HER2 en EGFR kinase assay

Het cytoplasmatische domein (aminozuren 676-1255) van humaan HER2 en het cytoplasmatische domein (aminozuren 669-1210) van humaan EGFR worden tot expressie gebracht als N-terminaal peptide (DYKDDDD)-getagd eiwit met behulp van een baculovirus-expressiesysteem. De tot expressie gebrachte HER2 kinase en EGFR kinase worden gezuiverd door anti-FLAG M2 affiniteitsgel. De EGFR en HER2 kinase assays worden uitgevoerd met radiogelabeld [γ-³²P]ATP in 96-wells platen. De kinasereacties worden uitgevoerd in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MnCl₂, 0,01% Tween 20 en 2 mM DTT, bevattende 0,9 μCi [γ-³²P]ATP per reactie, 50 μM ATP, 5 μg/mL poly(Glu)-Tyr (4:1), en elk gezuiverd cytoplasmatisch domein (0,25 μg/mL EGFR of HER2) in een totaal volume van 50 μL. Om de IC50-waarde voor enzymremming te meten, worden toenemende concentraties van dit compound gedurende 5 minuten vóór de reactie bij kamertemperatuur geïncubeerd met het enzym. De kinasereacties worden geïnitieerd door ATP toe te voegen. Na 10 minuten bij kamertemperatuur worden de reacties gestopt door de toevoeging van 10% (eindconcentratie) trichloorazijnzuur. De γ-³²P gefosforyleerde eiwitten worden gefilterd in een oogstplaat met een celoogster en vrijgewassen van [γ-³²P]ATP met 3% fosforzuur. De platen worden gedroogd, gevolgd door de toevoeging van 25 μL MicroScint0. De radioactiviteit wordt geteld door een TopCount scintillatieteller. IC50-waarden worden berekend door niet-lineaire regressieanalyse van de procentuele remmingen.

De orale biologische beschikbaarheid van TAK-285 is 97,7% bij ratten en 72,2% bij muizen bij een dosis van 50 mg/kg. Orale toediening van deze verbinding met 100 mg/kg tweemaal daags gedurende 14 dagen toont significante antitumorale werkzaamheid in het HER2-overexpresserende BT-474 tumor xenograft muismodel met een tumor/controle (T/C) verhouding van 29%, zonder invloed op het lichaamsgewicht. Vergelijkbaar met het BT-474 model, vertoont deze verbinding dosisafhankelijke tumorgroei-inhibitie van 4-1ST (HER2-overexpresserende menselijke maagkankertumor) xenografts bij muizen, met T/C van 44% en 11% bij doses van respectievelijk 50 mg/kg en 100 mg/kg, tweemaal daags, zonder significant gewichtsverlies bij muizen. Bovendien induceert deze chemische behandeling dosisafhankelijke groei-inhibitie van 4-1ST tumoren bij ratten met T/C van 38% en 14% bij doses van 6,25 mg/kg en 12,5 mg/kg, en, bijzonder opmerkelijk, tumorregressie met T/C van -12% en -16% bij doses van respectievelijk 25 mg/kg en 50 mg/kg. [1] Na orale toediening van deze verbinding is een significante hoeveelheid van deze verbinding aanwezig in de hersenen van ratten in farmacologisch actieve, ongebonden vorm (ongeveer 20% van het vrije plasmaniveau), wat aangeeft dat deze verbinding potentieel heeft bij de therapie van CZS-maligniteiten/metastasen. [3]