Golvatinib (E7050) c-Met remmer

In vitro studies geven aan dat Golvatinib (E7050) krachtig de fosforylering van zowel c-Met als VEGFR-2 remt. Het onderdrukt ook krachtig de groei van zowel c-Met geamplificeerde tumorcellen als endotheelcellen gestimuleerd met HGF of VEGF. [1] Deze verbinding omzeilt resistentie tegen alle reversibele, irreversibele en mutant-selectieve EGFR-TKI's geïnduceerd door exogeen en/of endogeen HGF in EGFR-mutante longkankercellijnen, door de Met/Gab1/PI3K/Akt-route in vitro te blokkeren. Het voorkomt ook het ontstaan van gefitinib-resistente HCC827-cellen geïnduceerd door continue blootstelling aan HGF. [2]

Western blot analyse

De fosforyleringsstatus van c-Met en VEGFR-2 wordt gedetecteerd door Western blot analyse. Voor c-Met worden MKN45-cellen geïncubeerd met een seriële verdunning van Golvatinib (E7050) in compleet medium bij 37 °C gedurende 2 uur. Voor VEGFR-2 worden HUVEC uitgehongerd met humaan endotheel serumvrij medium dat 0,5% FBS bevat gedurende 24 uur. Vervolgens worden HUVEC geïncubeerd met een seriële verdunning van dit compound gedurende 1 uur en daarna geïncubeerd met 20 ng/mL humaan VEGF gedurende 5 minuten. Cellen worden gelyseerd met lysisbuffer (50 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA [pH 8.0], 100 mM NaF, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 1 mM natriumorthovanadaat, 10 μg/mL aprotinine, 50 μg/mL leupeptine en 1 μg/mL pepstatine A). De geresecteerde tumorweefsels worden gehomogeniseerd met lysisbuffer die 25 mM β-glycerofosfaat en 0,5% (v/v) fosfatase-remmercocktail 2 bevat bij 4 °C. Cellulaire debris wordt verwijderd door centrifugatie bij 17 860 g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Aliquoten van de supernatant die 5-20 μg eiwit bevatten, worden onder reducerende omstandigheden onderworpen aan SDS-PAGE. De eiwitten worden vervolgens overgebracht op PVDF-membranen, geblokkeerd met TBS dat 0,05% Tween-20 en ofwel 5% magere melk of 5% BSA bevat. De membranen worden geprobeerd met de volgende antilichamen: polyklonaal anti-c-Met antilichaam (C-28) en polyklonaal anti-VEGFR-2 antilichaam (C-20); muizen anti-fosfotyrosine kloon 4G10; en polyklonaal anti-VEGFR-2 antilichaam, polyklonaal anti-fosfo-VEGFR-2 (Tyr996) antilichaam, en polyklonaal anti-fosfo-c-Met (Tyr1234/1235) antilichaam. Detectie wordt uitgevoerd met behulp van een Super Signal enhanced chemiluminescence kit. Immunoreactieve banden worden gevisualiseerd door chemiluminescentie met een Image Master-VDS-CL detectiesysteem. De intensiteit van elke band wordt gemeten met behulp van een beeldanalysator.

Golvatinib (E7050) vertoont in vivo remming van de fosforylering van c-Met en VEGFR-2 in tumoren, met sterke onderdrukking van tumorgroei en angiogenese in xenograftmodellen. Behandeling van sommige tumorlijnen met c-Met-amplificaties met hoge doses van dit compound (50–200 mg/kg) induceert tumorregressie en -verdwijning. In een model van peritoneale disseminatie toont het een antitumor effect tegen peritoneale tumoren, evenals een significante verlenging van de levensduur bij behandelde muizen. [1] In een andere xenograftstudie zijn tumoren geproduceerd door HGF-getransfecteerde Ma-1 (Ma-1/HGF) cellen angiogenischer dan vectorcontrol-tumoren en vertonen ze resistentie tegen ZD1839. E7050 alleen remt angiogenese en vertraagt de groei van Ma-1/HGF-tumoren, en in combinatie met ZD1839 induceert het een duidelijke regressie van tumorgroei. [3]