NVP-BVU972 c-Met remmer

NVP-BVU972 remt de MET-kinase krachtig, maar vertoont een lage remming tegen andere kinasen, waaronder de meest nauw verwante kinase RON, met IC50-waarden van meer dan 1000 nM. Deze verbinding onderdrukt ook constitutieve MET-fosforylering in GTL-16-cellen of HGF-gestimuleerde MET-fosforylering in A549-cellen met IC50-waarden van respectievelijk 7,3 nM en 22 nM. Het voorkomt krachtig de groei van de MET-gen geamplificeerde cellijnen GTL-16, MKN-45 en EBC-1 met IC50-waarden van respectievelijk 66 nM, 82 nM en 32 nM. In lijn met hun hoge frequentie in dit verbindingenscreen, veroorzaken Y1230- en D1228-mutaties dramatische verschuivingen in de gemeten IC50-waarden hiervoor in de BaF3-cellijn. Resistentie veroorzaakt door V1155L is meer beperkt tot deze chemische stof. Een dosisafhankelijke reductie in TPR-MET-fosforylering bij toepassing op BaF3-cellen die wildtype TPR-MET tot expressie brengen. Zowel Y1230H- als D1228A-mutaties hieven het effect van deze verbinding op, maar niet dat van AMG 458. Echter, F1200I en L1195V interfereren met de potentie ervan om TPR-MET-fosforylering te voorkomen.[1]

TR-FRET biochemische test met MET wildtype en mutanten

Enzymactiviteit wordt gemeten in een tijdsopgeloste fluorescentie resonantie energieoverdracht (TR-FRET) test, die tyrosinfosforylering detecteert met een Eu-gelabeld anti-fosfo-tyrosine antilichaam (fluorescentiedonor) en allophycocyanine geconjugeerd aan streptavidine (fluorescentieacceptor) dat bindt aan een biotine op het substraatpeptide. Voor elke variant worden K_m-concentraties voor ATP bepaald in afwezigheid van deze verbinding, en de ATP-concentratie in de kinase-reactie wordt ingesteld op K_m (4 μM voor MET wt, 1 μM voor MET Y1230H en MET F1200I). Het wordt opgelost en verdund in DMSO en in viervoud getest. Kinase-reacties worden uitgevoerd in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 8 mM MgCl₂, 4 mM MnCl₂, 0,05 % Tween 20, 0,05% runderserumalbumine, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 mM Na₃VO₄, in witte 1536-well platen bij kamertemperatuur. Deze chemische stof en het enzym worden geïncubeerd in een volume van 2 μL gedurende 20 min, gevolgd door de toevoeging van 1 μL ATP en 1 μL gebiotinyleerd peptidesubstraat (PTK1) tot eindconcentraties van respectievelijk K_m en 1 μM. Enzymconcentraties in de reacties zijn 5 nM voor MET wt, en 4 nM voor de F1200I en Y1230H varianten. Na 90 min worden de reacties gestopt door toevoeging van 1 μL stop/detectieoplossing om eindconcentraties van 10 mM EDTA, 3,5 nM Eu-gelabeld antifosfo-tyrosine antilichaam PY20 en 10 nM streptavidine allophycocyanine te bereiken. Tijdsopgeloste fluorescentie resonantie energieoverdracht wordt gemeten in een Envision plaatlezer (excitatie 320 nm, emissie 615 nm en 665 nm).