AT7519 HCl CDK remmer

AT7519 is een ATP-competitieve CDK-remmer met een K_i-waarde van 38 nM voor CDK1. AT7519 is inactief tegen alle niet-CDK-kinasen met uitzondering van GSK3β (IC50 = 89 nM). AT7519 vertoont een potente antiproliferatieve activiteit in een verscheidenheid aan menselijke tumorcellijnen met IC50-waarden variërend van 40 nM voor MCF-7 tot 940 nM voor SW620, consistent met de remming van CDK1 en CDK2. [1] AT7519 induceert dosisafhankelijke cytotoxiciteit in myeloom (MM) cellijnen met IC50-waarden variërend van 0,5 tot 2 μM na 48 uur, waarbij de meest gevoelige cellijnen MM.1S (0,5 μM) en U266 (0,5 μM) zijn en de meest resistente MM.1R (>2 μM). Het induceert geen cytotoxiciteit in perifere bloedmononucleaire cellen (PBMNC). AT7519 overwint gedeeltelijk het proliferatieve voordeel dat wordt verleend door IL6 en IGF-1, evenals het beschermende effect van beenmergstamcellen (BMSC's). AT7519 induceert snelle defosforylering van RNA pol II CTD op serine 2- en serine 5-plaatsen en leidt tot de remming van transcriptie, gedeeltelijk bijdragend aan de AT7519-geïnduceerde cytotoxiciteit van MM-cellen. AT7519 induceert activering van GSK-3β door GSK-3β-fosforylering te downreguleren, wat ook bijdraagt aan de AT7519-geïnduceerde apoptose onafhankelijk van de remming van transcriptie. [2]

In vitro Kinase Assays

Kinase-assays voor CDK1, CDK2 en GSK3-β worden allemaal uitgevoerd in een radiometrisch filterbindingformaat. Assays voor CDK5 zijn in DELFIA-formaat en voor CDK's 4 en 6 in ELISA-formaat. Voor CDK's 1 en 2 worden de relevante CDK en 0,12 μg/mL Histone H1 geïncubeerd in 20 mM MOPS, pH 7,2, 25 mM β-glycerofosfaat, 5 mM EDTA, 15 mM MgCl₂, 1 mM natriumorthovanadaat, 1 mM DTT, 0,1 mg/mL BSA, 45 μM ATP (0,78 Ci/mmol) en verschillende concentraties van AT7519 gedurende respectievelijk 2 of 4 uur. Voor GSK3-β worden het relevante enzym en 5 μM glycogeen synthase peptide 2 samen met 10 mM MOPS pH 7,0, 0,1 mg/mL BSA, 0,001% Brij-35, 0,5% glycerol, 0,2 mM EDTA, 10 mM MgCl₂, 0,01% β-mercapto-ethanol, 15 μM ATP (2,31 Ci/mmol) en verschillende concentraties van AT7519 gedurende 3 uur geïncubeerd. Assay-reacties worden gestopt door een overmaat orthofosforzuur toe te voegen en gefilterd met Millipore MAPH-filterplaten. De platen worden vervolgens gewassen, scintillant toegevoegd en radioactiviteit gemeten door scintillatietelling op een Packard TopCount. Voor CDK5 worden CDK5/p35 en 1 μM van een gebiotinyleerd Histone H1-peptide (Biotin-PKTPKKAKKL) geïncubeerd in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2,5 mM MgCl₂, 0,025% Brij-35, 0,1 mg/mL BSA, 1 mM DTT, 15 μM ATP en verschillende concentraties van AT7519 gedurende 30 minuten. Assay-reacties worden gestopt met EDTA, overgebracht naar Neutravidine-gecoate platen en gefosforyleerd peptide wordt gekwantificeerd met behulp van een konijn phospho-cdk1-substraat polyclonaal antilichaam en DELFIA europium-gelabeld anti-konijn IgG secundair antilichaam met behulp van tijdopgeloste fluorescentie bij λ_ex=335nm, λ_em=620nm. Voor CDK 4 en 6 assays worden platen gecoat met GST-pRb769-921 en geblokkeerd met Superblock. CDK4 of 6 wordt geïncubeerd met 15 mM MgCl₂, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, pH 8,0, 0,02% Triton X-100, 2,5% DMSO en verschillende concentraties van AT7519; de reactie wordt geïnitieerd door toevoeging van ATP. Na 30 minuten worden reacties gestopt door toevoeging van 0,5 M EDTA pH 8,0. Platen worden vervolgens gewassen en gedurende één uur geïncubeerd met het primaire antilichaam (anti-p-Rb Serine 780) verdund in Superblock, gevolgd door secundair antilichaam (alkalische fosfatase gekoppeld anti-konijn) gedurende nog een uur. Platen worden ontwikkeld met behulp van het Attophos-systeem en fluorescentie wordt afgelezen op een Spectramax Gemini plaatlezer bij excitatie 450 nm en emissie 580 nm. In alle gevallen worden IC50-waarden berekend uit replica-curven, met behulp van GraphPad Prism-software.

Een tweemaal daagse dosering van AT7519 (9,1 mg/kg) veroorzaakt tumorregressie van zowel vroeg- als laatstadium s.c. tumoren in de HCT116 en HT29 colonkanker xenograftmodellen. [1] AT7519-behandeling (15 mg/kg) remt de tumorgroei en verlengt de mediane algehele overleving van muizen in het humane MM xenograftmuismodel in samenhang met verhoogde caspase 3-activering. [2]