(R)-(-)-Gossypol (AT-101) acetic acid Bcl-2 remmer

AT-101 remt een panel van verschillende lymfoproliferatieve maligniteiten met IC50 variërend van 1,2 μM tot 7,4 μM. AT-101 (10 μM) verstoort de Δψm op een concentratie- en tijdsafhankelijke manier in diffuse grootcellige B-cel- en mantelcellymfoomlijnen. AT-101 (1 μM of 2 μM) gecombineerd met carfilzomib (6 nM of 10 nM) induceert apoptose in HBL-2- en Granta-cellijnen. [2] AT-101 (20 μM gedurende 24 uur) resulteert in een mediane apoptose van 72% en down-regulatie van Mcl-1 in CLL-lymfocyten zowel in suspensiekweek als in stromale cocultuur. Stromale cellen expresseren ondetecteerbare niveaus van antiapoptotische maar hoge niveaus van geactiveerde ERK- en AKT-eiwitten en hebben weinig of geen apoptose met AT-101. [3] AT-101 induceert apoptose op een tijd- en dosisafhankelijke manier, met ED50-waarden van respectievelijk 1,9 mM en 2,4 mM in Jurkat T- en U937-cellen. AT-101 (10 μM) gecombineerd met straling (32 Gy) induceert meer apoptose dan straling alleen en overschrijdt de som van de effecten veroorzaakt door de enkelvoudige middelen. AT-101 activeert SAPK/JNK op een dosis- en tijdsafhankelijke manier. [4] AT-101 (10 µM) induceert apoptose door activering van caspase-9, -3 en -7 in VCaP-cellen. AT-101 (10 µM) vermindert Bcl-2- en Mcl-1-expressie in VCaP-cellen. [5] AT-101 (< 20 μM) is in staat de groei van multipel myeloomcellen te remmen ondanks de stimulerende groeieffecten die worden geleverd door stromale cellen in het beenmergmilieu. AT-101 (10 μM) induceert apoptose in multipel myeloomcellen via de activering van caspasen 3, caspasen 9 en PARP. AT-101 (10 μM) bevordert apoptose in multipel myeloomcellen door de Bax/Bcl-2-verhouding en de mitochondriale membraanpotentiaal te verstoren. [6]

Fluorescentiepolarisatie-gebaseerde bindingsassay

Voor competitieve bindings experimenten worden Bcl-2-eiwit (40 nM) en FAM-Bid-peptide (2,5 nM) voor-geïncubeerd in de assaybuffer (100 mM kaliumfosfaat, pH 7,5; 100 μg/mL bovien gammaglobuline; 0,02% natriumazide). 5 μL van een oplossing in DMSO van AT101 wordt toegevoegd aan de Bcl-2/FAM-Bid-oplossing in Dynex 96-well, zwarte, rondbodemplaten om een eindvolume van 125 μL te produceren. Voor elk experiment worden een controle met Bcl-2 en Flu-Bid-peptide (gelijk aan 0% remming) en een andere controle met alleen FAM-Bid opgenomen op elke assayplaat. Na 4 uur incubatie werden de polarisatiewaarden in milipolarisatie-eenheden (mP) gemeten bij een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 530 nm met behulp van de Ultra plaatlezer. IC50, de remmerconcentratie waarbij 50% van het gebonden peptide wordt verdrongen, wordt bepaald uit de plot met behulp van niet-lineaire kleinste-kwadratenanalyse en curve-fitting uitgevoerd met GraphPad Prizm 4 software. Het ongelabelde Bid BH3-peptide wordt gebruikt als positieve controle. PF voor Bcl-xL-eiwit, Bak BH3-peptide gelabeld met 6-carboxyfluoresceïne succinimidyl ester (FAM-Bak) in plaats van de FAM-Bim om het signaal te maximaliseren. Er wordt vastgesteld dat FAM-Bak een Kd heeft van 6 nM tot Bcl-xL-eiwit. De competitieve bindingsassay voor Bcl-xL is hetzelfde als die voor Bcl-2 met de volgende uitzonderingen. 30 nM Bcl-xL-eiwit en 2,5 nM FAM-Bak-peptide in de volgende assaybuffer: 50 mM Tris-Bis, pH 7,4 en 0,01% bovien gammaglobuline. PF voor Mcl-1-eiwit, FAM-Bid-peptide en humaan Mcl-1-eiwit worden gebruikt. Er wordt vastgesteld dat FAM-Bid-peptide bindt aan humaan Mcl-1-eiwit met een Kd van 1,71 nM. De competitieve bindingsassays voor Mcl-1 worden op dezelfde manier uitgevoerd als die voor Bcl-2 met de volgende uitzonderingen. 5 nM Mcl-1 en 1 nM Flu-Bid-peptide in de volgende assaybuffer: 25 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCl en 0,05% Pluronic acid.

AT-101 is nog steeds detecteerbaar in plasma met gemiddelde concentraties van 0,49 μM voor de 35 mg/kg-groep en 0,39 μM voor de 200 mg/kg-groep in SCID beige muizen met RL-DLBCL-xenograft. AT-101 piekplasmaconcentratie wordt waargenomen na 30 minuten toediening van het medicijn in beide dosisniveaus, waarbij de 200 mg/kg-groep een gemiddelde plasmaconcentratie vertoont die bijna 4 keer groter is dan de 35 mg/kg-groep (respectievelijk 7,88 μM en 27,78 μM) in SCID beige muizen. AT-101 (25 mg/kg tot 100 mg/kg, oraal) resulteert onbeperkt in een eerdere aanvang van gewichtsverlies gelijk aan meer dan 10% van het voorbehandelingsgewicht en de dood bij SCID beige muizen. AT-101 (35 mg/kg, oraal per dag gedurende 10 dagen) plus intraperitoneaal cyclofosfamide (Cy) en intraperitoneaal rituximab (R) tonen significante tumorvolumeregeling vergeleken met elke andere behandelingsgroep. [2] AT-101 (15 mg/kg, p.o., 5 dagen/week) als enkelvoudig middel in intacte muizen vermindert de ontwikkeling van VCaP-tumorgroei significant vergeleken met onbehandelde tumoren in weken 2 tot 6. AT-101 in combinatie met chirurgische castratie vertraagt het begin van androgeen-onafhankelijke VCaP-tumorgroei vergeleken met alleen castratie- of alleen AT-101-groepen bij muizen. [5]