AMG319 PI3K remmer

AMG319 remt anti-IgM/CD40L-geïnduceerde B-celproliferatie met een IC50 van 8,6 nM en verlaagt het pAkt-niveau met een IC50 van 1,5 nM. Deze verbinding remt ook anti-IgD-geïnduceerde CD-69-expressie in HWB. [1]

PI3K enzymtests

Een PI3K Alphascreen-assay wordt gebruikt om de activiteit te meten van een panel van vier fosfo-inositide 3-kinases: PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kγ en PI3Kδ. Enzymreactiebuffer wordt bereid met steriel water en 50 mM Tris-HCl, pH 7, 14 mM MgCl₂, 2 mM natriumcholaat en 100 mM NaCl. 2 mM DTT wordt vers toegevoegd op de dag van het experiment. De Alphascreen-buffer wordt gemaakt met steriel water en 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,10% Tween 20 en 30 mM EDTA. Vervolgens wordt 1 mM DTT vers toegevoegd op de dag van het experiment. Compoundbronplaten die voor deze assay worden gebruikt, zijn 384-wells Greiner heldere polypropyleenplaten die testverbindingen bevatten bij 5 mM en 1:2 verdund over 22 concentraties. Kolommen 23 en 24 bevatten alleen DMSO, aangezien deze putjes respectievelijk de positieve en negatieve controles omvatten. Bronplaten worden gerepliceerd door 0,5 μL per putje over te brengen naar 384-wells Optiplates. Elke PI3K-isoform wordt verdund in enzymreactiebuffer tot 2× werkvoorraden. PI3Kα wordt verdund tot 1,6 nM, PI3Kβ wordt verdund tot 0,8 nM, PI3Kγ wordt verdund tot 15 nM en PI3Kδ wordt verdund tot 1,6 nM. PI(4,5)P2 wordt verdund tot 10 μM en ATP werd verdund tot 20 μM. Deze 2× voorraad wordt gebruikt in de assays voor PI3Kα en PI3Kβ. Voor de assay van PI3Kγ en PI3Kδ wordt PI(4,5)P2 verdund tot 10 μM en ATP werd verdund tot 8 μM om een vergelijkbare 2× werkvoorraad te bereiden. Alphascreen-reactieoplossingen worden gemaakt met behulp van beads uit de anti-GST Alphascreen-kit. Twee 4× werkvoorraden van de Alphascreen-reagentia worden gemaakt in Alphascreen-reactiebuffer. In één voorraad wordt gebiotinyleerd-IP4 verdund tot 40 nM en streptavadin-donor-beads worden verdund tot 80 μg/mL. In de tweede voorraad wordt PIP3-bindend eiwit verdund tot 40 nM en anti-GST-acceptor-beads werden verdund tot 80 μg/mL. Als negatieve controle wordt een referentieremmer in een concentratie ≫Ki (40 μM) opgenomen in kolom 24 als negatieve (100% remming) controle. Met behulp van een 384-wells Multidrop wordt 10 μL/putje van 2× enzymvoorraad toegevoegd aan kolommen 1–24 van de assayplaten voor elke isoform. Een hoeveelheid van 10 μL/putje van de juiste substraat 2× voorraad (die 20 μM ATP bevat voor de PI3Kα- en -β-assays en 8 μM ATP bevat voor de PI3Kγ- en -δ-assays) wordt vervolgens toegevoegd aan kolommen 1–24 van alle platen. Platen worden vervolgens 20 min bij kamertemperatuur geïncubeerd. In het donker wordt 10 μL/putje van de donor-bead-oplossing toegevoegd aan kolommen 1–24 van de platen om de enzymreactie te doven. De platen worden 30 min bij kamertemperatuur geïncubeerd. Nog steeds in het donker wordt 10 μL/putje van de acceptor-bead-oplossing toegevoegd aan kolommen 1–24 van de platen. De platen worden vervolgens 1,5 uur in het donker geïncubeerd. De platen worden afgelezen op een Envision multimode plaatlezer met een 680 nm excitatie filter en een 520–620 nm emissiefilter.

Bij vrouwelijke Lewis-ratten remt AMG319 (3 mg/kg, p.o.) de KLH-geïnduceerde ontstekingsreactie met 88%. Bij transgene (IgMm) muizen remt deze verbinding (, p.o.) in vivo pAKT met een IC50 van 1,9 nM. [1]