NVP-BSK805 2HCl JAK Remmer

NVP-BSK805 is found to potently inhibit JAK2, whereas displaying more than 20-fold selectivity towards JAK1, JAK3, and TYK2. NVP-BSK805 causes half-maximal inhibition of full-length JAK2^V617F and JAK2 wild-type enzymes at 0.5 nM. NVP-BSK805 blocks the growth of JAK2^V617F cells (Ba/F3) and induces apoptosis with a GI50 at concentrations ＜100 nM. As constitutive STAT5 phosphorylation in dependent on JAK2, NVP-BSK805 is found to potently suppress STAT5 phophorylation at ≥ 100 nM concentrations in the JAK2 ^V617F -mutant cell lines, like MB-02. Incubation of SET-2 cells with 150 nM and 1µM of NVP-BSK805, which corresponds to concentration yielding 75% and 95% growth inhibition, respectively, for 24, 48, and 72 hours lead to concentration- and time- dependent induction of apoptosis. These results are evidenced by the detection of cleaved PARP, reduced Bcl-xL expression, and a strong increase in the number of cells with less than 2N DNA content. [1] NVP-BSK805 triggered cell death requires activation of caspase cascades and is overcome by caspase inhibition in both SET-2 and MB-02 cells. NVP-BSK805 modulates the post-translational modification of Bim and levels of Mcl-1 in JAK2^V617F cells, SET-2 and MB-02 cells. [2]

Enzymatische assays

Het humane JAK2-kinasedomein (aminozuren 840-1132) is opgenomen in het plasmideconstruct pAcG2TtevJAK2. De plasmideconstructen voor JAK3 (813-1124), TYK2 (888-1187) en JAK1 (866-1154) zijn ontworpen. De generatie van de recombinante baculovirussen met BD BaculoGold^TM Bright gelineariseerde DNA, plaque-assay en virusamplificatie uit enkele plaques wordt uitgevoerd volgens de handleiding (BD Biosciences Pharmingen). Janus-kinasedomeinen worden tot expressie gebracht in Sf9-cellen in 400 ml schudflessen met 100 ml ExCell420-kweekmedium (JRH Biosciences Ltd) met penicilline/streptomycinesoplossing gedurende 48 uur bij 27°C. Suspensiekweekcellen worden geïnfecteerd met een dichtheid van 1 × 10⁶ en de multipliciteit van infectie (MOI) voor elk virus wordt geoptimaliseerd voor de opbrengst aan oplosbaar eiwit. Het kinasedomein van humaan JAK2 en van JAK1, JAK3 en TYK2 wordt tot expressie gebracht met een MOI van respectievelijk 1 en 0,5. De expressietijd bij 27°C is 48 uur voor JAK2 en 48 uur of 72 uur voor JAK1, JAK3 en TYK2. Acht en veertig of twee en zeventig uur na infectie worden de cellen van een 100 ml expressiekweek geoogst door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 5 minuten en gelijseerd met 12 ml lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM natriumorthovanadaat, 1 % Triton X-100, 10 % glycerol, 1 x EDTA-vrij compleet protease-inhibitorcocktail (Roche Diagnostics) en 12,5 U/ml Benzonase gedurende 30 minuten bij 4°C, gevolgd door centrifugeren bij 14.000 × g gedurende 45 minuten om onoplosbaar materiaal te pelletiseren. Voor GST-tag-affiniteitszuivering van kinasedomeineiwitten worden alle stappen uitgevoerd bij 4°C. De geklaarde lysaten worden geïncubeerd met 0,2 ml van een 50 % suspensie van gewassen Glutathione Sepharose 4B gedurende 2 uur bij 4°C, gevolgd door 5 wasbeurten met 1 ml van 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT en 10 % glycerol. Gebonden eiwit wordt geëlueerd in 5 aliquots, elk beginnend met een 10 minuten incubatie met 0,25 ml elutiebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT, 10 % glycerol, 10 mM gereduceerd L-glutathion). Eluaten worden ongeveer 5-voudig geconcentreerd met Amicon Ultra-4 spinkolommen. Na toevoeging van Brij35 tot 0,1 % eindconcentratie wordt het eiwit snel ingevroren in kleine aliquots en opgeslagen bij -80°C. Onder deze omstandigheden zijn kinase-activiteiten minstens 6 maanden stabiel. De JAK kinasedomeinenzymen worden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd in een medium dat 0,1 μM [γ³³P]-ATP, 1 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂, 30 μM synthetisch peptidesubstraat EQEDEPEGDYFEWLE, 1 mM DTT, 1 % DMSO, 50 μg/ml BSA, 0,01 % Brij35 en 50 mM Tris-HCl pH 7,5 bevat. De ATP-concentratie ligt onder de Km voor alle eiwitten. Curven worden gefit door niet-lineaire regressie met behulp van de logistische vergelijking en de globale fit-functie van XLfit® (model 205). Expressie en karakterisering van full-length wild type en V617F mutant JAK2, evenals kinase-assay-condities, zijn elders beschreven. Kinase-selectiviteit van NVP-BSK805 wordt beoordeeld in een intern kinase-panel: In de Caliper-assays worden kinasereacties uitgevoerd met peptidesubstraten die met verschillende snelheden in een elektrisch veld migreren wanneer ze gefosforyleerd zijn. De peptiden dragen een fluorescerend label om de detectie en kwantificatie van de peptiden in een capillairsysteem mogelijk te maken. Peptidefluorescentie-intensiteiten worden gekwantificeerd met behulp van het LC3000-instrument (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA). Kinase-activiteit wordt gemeten door de hoeveelheid ATP die na een kinasereactie in oplossing blijft, te kwantificeren. In de LanthaScreen™ TR-FRET kinase-assays wordt terbium gebruikt als het lanthanidechelaat, gecombineerd met een antilichaam gericht tegen het gefosforyleerde substraat.

Oral bioavailability of NVP-BSK805 in mice is estimated to be 45%, while it is 50% in rats. Oral administration of NVP-BSK805 at 150 mg/kg suppresses STAT5 phosphorylation, splenomegaly, and leukemic cell spreading in a Ba/F3 JAK2^V617F cell–driven mouse model. NVP-BSK805 suppresses rhEpo-induced STAT5 phosphorylation as well as rhEpo-mediated polycythemia and splenomegaly in BALB/c mice at doses of 25, 50, and 100 mg/kg orally. [1]