NVP-BSK805 2HCl JAK remmer

NVP-BSK805 blijkt JAK2 krachtig te remmen, terwijl het een meer dan 20-voudige selectiviteit vertoont ten opzichte van JAK1, JAK3 en TYK2. NVP-BSK805 veroorzaakt een half-maximale remming van full-length JAK2^V617F en JAK2 wild-type enzymen bij 0,5 nM. NVP-BSK805 blokkeert de groei van JAK2^V617F-cellen (Ba/F3) en induceert apoptose met een GI50 bij concentraties <100 nM. Aangezien constitutieve STAT5-fosforylering afhankelijk is van JAK2, blijkt NVP-BSK805 de STAT5-fosforylering bij concentraties van ">= 100 nM in de JAK2^V617F-mutante cellijnen, zoals MB-02, krachtig te onderdrukken. Incubatie van SET-2-cellen met 150 nM en 1 µM NVP-BSK805, wat overeenkomt met concentraties die respectievelijk 75% en 95% groeiremming opleveren, gedurende 24, 48 en 72 uur leidt tot een concentratie- en tijdsafhankelijke inductie van apoptose. Deze resultaten worden bewezen door de detectie van gekliefd PARP, verminderde Bcl-xL-expressie en een sterke toename van het aantal cellen met minder dan 2N DNA-gehalte. [1] NVP-BSK805-geïnduceerde celdood vereist activering van caspase-cascades en wordt overwonnen door caspase-remming in zowel SET-2- als MB-02-cellen. NVP-BSK805 moduleert de post-translationele modificatie van Bim en de niveaus van Mcl-1 in JAK2^V617F-cellen, SET-2- en MB-02-cellen. [2]

Enzymatische assays

Het humane JAK2-kinasedomein (aminozuren 840-1132) is opgenomen in het plasmideconstruct pAcG2TtevJAK2. De plasmideconstructen voor JAK3 (813-1124), TYK2 (888-1187) en JAK1 (866-1154) zijn ontworpen. De generatie van de recombinante baculovirussen met BD BaculoGold^TM Bright gelineariseerde DNA, plaque-assay en virusamplificatie uit enkele plaques wordt uitgevoerd volgens de handleiding (BD Biosciences Pharmingen). Janus-kinasedomeinen worden tot expressie gebracht in Sf9-cellen in 400 ml schudflessen met 100 ml ExCell420-kweekmedium (JRH Biosciences Ltd) met penicilline/streptomycinesoplossing gedurende 48 uur bij 27°C. Suspensiekweekcellen worden geïnfecteerd met een dichtheid van 1 × 10⁶ en de multipliciteit van infectie (MOI) voor elk virus wordt geoptimaliseerd voor de opbrengst aan oplosbaar eiwit. Het kinasedomein van humaan JAK2 en van JAK1, JAK3 en TYK2 wordt tot expressie gebracht met een MOI van respectievelijk 1 en 0,5. De expressietijd bij 27°C is 48 uur voor JAK2 en 48 uur of 72 uur voor JAK1, JAK3 en TYK2. Acht en veertig of twee en zeventig uur na infectie worden de cellen van een 100 ml expressiekweek geoogst door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 5 minuten en gelijseerd met 12 ml lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM natriumorthovanadaat, 1 % Triton X-100, 10 % glycerol, 1 x EDTA-vrij compleet protease-inhibitorcocktail (Roche Diagnostics) en 12,5 U/ml Benzonase gedurende 30 minuten bij 4°C, gevolgd door centrifugeren bij 14.000 × g gedurende 45 minuten om onoplosbaar materiaal te pelletiseren. Voor GST-tag-affiniteitszuivering van kinasedomeineiwitten worden alle stappen uitgevoerd bij 4°C. De geklaarde lysaten worden geïncubeerd met 0,2 ml van een 50 % suspensie van gewassen Glutathione Sepharose 4B gedurende 2 uur bij 4°C, gevolgd door 5 wasbeurten met 1 ml van 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT en 10 % glycerol. Gebonden eiwit wordt geëlueerd in 5 aliquots, elk beginnend met een 10 minuten incubatie met 0,25 ml elutiebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT, 10 % glycerol, 10 mM gereduceerd L-glutathion). Eluaten worden ongeveer 5-voudig geconcentreerd met Amicon Ultra-4 spinkolommen. Na toevoeging van Brij35 tot 0,1 % eindconcentratie wordt het eiwit snel ingevroren in kleine aliquots en opgeslagen bij -80°C. Onder deze omstandigheden zijn kinase-activiteiten minstens 6 maanden stabiel. De JAK kinasedomeinenzymen worden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd in een medium dat 0,1 μM [γ³³P]-ATP, 1 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂, 30 μM synthetisch peptidesubstraat EQEDEPEGDYFEWLE, 1 mM DTT, 1 % DMSO, 50 μg/ml BSA, 0,01 % Brij35 en 50 mM Tris-HCl pH 7,5 bevat. De ATP-concentratie ligt onder de Km voor alle eiwitten. Curven worden gefit door niet-lineaire regressie met behulp van de logistische vergelijking en de globale fit-functie van XLfit® (model 205). Expressie en karakterisering van full-length wild type en V617F mutant JAK2, evenals kinase-assay-condities, zijn elders beschreven. Kinase-selectiviteit van NVP-BSK805 wordt beoordeeld in een intern kinase-panel: In de Caliper-assays worden kinasereacties uitgevoerd met peptidesubstraten die met verschillende snelheden in een elektrisch veld migreren wanneer ze gefosforyleerd zijn. De peptiden dragen een fluorescerend label om de detectie en kwantificatie van de peptiden in een capillairsysteem mogelijk te maken. Peptidefluorescentie-intensiteiten worden gekwantificeerd met behulp van het LC3000-instrument (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA). Kinase-activiteit wordt gemeten door de hoeveelheid ATP die na een kinasereactie in oplossing blijft, te kwantificeren. In de LanthaScreen™ TR-FRET kinase-assays wordt terbium gebruikt als het lanthanidechelaat, gecombineerd met een antilichaam gericht tegen het gefosforyleerde substraat.

De orale biologische beschikbaarheid van NVP-BSK805 bij muizen wordt geschat op 45%, terwijl deze bij ratten 50% bedraagt. Orale toediening van NVP-BSK805 bij 150 mg/kg onderdrukt STAT5-fosforylering, splenomegalie en leukemische celverspreiding in een Ba/F3 JAK2^V617F cel-gedreven muismodel. NVP-BSK805 onderdrukt rhEpo-geïnduceerde STAT5-fosforylering, evenals rhEpo-gemedieerde polycytemie en splenomegalie bij BALB/c-muizen bij orale doses van 25, 50 en 100 mg/kg. [1]