Sulforhodamine B sodium salt Dyes chemisch

Sulforhodamine B colorimetrische assay in celkweek om celproliferatie te analyseren
1. Bereid behandelingsoplossingen met voldoende volume voor triplicaten in 96-well platen (50 μl per replicaat) of zes replicaten in 384-well platen (10 μl per replicaat). Zorg ervoor dat de volumes rekening houden met pipetteervariaties.
2. Behandelingsoplossingen kunnen worden bereid in een waterige oplossing (bijv. Opti-MEM voor transfecties) of een geschikt oplosmiddel (bijv. DMSO).
3. Verwijder het medium van celmonolagen en was de cellen eenmaal met gesteriliseerde PBS. Voeg 1 ml (voor 100 mm platen) 0,25% trypsine toe om het celgroei-oppervlak gelijkmatig te bedekken.
4. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten of totdat cellen beginnen te dissociëren. Inactiveer trypsine met 10 volumes kweekmedium met FBS. Meng op en neer om een homogene single-cell suspensie te verkrijgen.
5. Breng de celsuspensie over naar een steriele Falcon-buis.
6. Bepaal de celconcentratie met behulp van een haemocytometerkamer met een 1:1 mengsel van celsuspensie en 0,4% trypaanblauwe oplossing. centrifugeer eventueel cellen voor het tellen om trypsine te wassen en resuspendeer in een groeimedium.
7. Pas de celconcentratie aan met groeimedium (10% FBS) voor een geschikte celdichtheid per well.
8. Meng behandelingsoplossingen en doseer 50 μl (96-well formaat) of 10 μl (384-well formaat) in elk well.
9. Meng de celsuspensie grondig en voeg 50 μl (96-well formaat) of 10 μl (384-well formaat) toe aan elk well met behandelingsoplossingen.
Opmerking: Zorg voor een gelijkmatige celverdeling op de wellbodem en vermijd schudden om 'ringeffecten' te voorkomen.
10. Zet drie wells apart voor onbehandelde of vehikelcontrole en drie wells voor achtergrondsubtractie en incubeer de plaat bij 37 °C met 5% CO2 totdat deze klaar is om af te lezen.
11. Voeg 25 μl (96-well formaat) of 5 μl (384-well formaat) koude 50% TCA direct toe aan het mediumsupernatant. Incubeer platen bij 4 °C gedurende 1 uur zonder te mengen.
12. Was platen vier keer door onder te dompelen in langzaam stromend kraanwater en overtollig water op een papieren handdoek te kloppen. Laat de plaat aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
13. Voeg 50 μl (96-well formaat) of 20 μl (384-well formaat) 0,04% SRB-oplossing toe aan elk well.
14. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en spoel platen vier keer met 1% azijnzuur (200 μl voor 96-well formaat of 30 μl voor 384-well formaat). Laat de plaat aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
15. Voeg 50 μl tot 100 μl van 10 mM tris base oplossing (pH 10,5) toe aan elk well en schud de plaat gedurende 10 minuten op een orbitale schudder om de eiwitgebonden kleurstof op te lossen.
16. Meet de absorptie bij 510 nm in een microplaatlezer.