Rebastinib (DCC-2036) Bcr-Abl inhibiteur

A conformational control inhibitor of Abl1 and T315I Abl1.

Rebastinib (DCC-2036) présente de puissantes activités inhibitrices contre l'Abl1 natif purifié sous formes non phosphorylées (u-Abl1^native) et phosphorylées (p-Abl1^native), l'Abl1^T315I mutant gatekeeper non phosphorylé et phosphorylé, et le mutant de la boucle d'activation Abl1^H396P de manière non compétitive avec l'ATP avec des valeurs d'IC50 de 0,8 nM, 2 nM, 1,4 nM, 5 nM et 4 nM, respectivement. De plus, il inhibe également les kinases de la famille Src Src, LYN, FGR et HCK, et les TKs récepteurs KDR, FLT3 et TIE2 avec des valeurs d'IC50 de 34 nM, 29 nM, 38 nM, 40 nM, 4 nM, 2 nM et 6 nM, respectivement. [1] Ce composé présente des activités antiprolifératives contre les cellules Ba/F3 exprimant Bcr-Abl1 natif ou mutant avec un IC50 allant de 2 nM à 150 nM. De plus, il inhibe également la prolifération de la lignée cellulaire Ph⁺ K562 (IC50 5,5 nM) et induit fortement l'apoptose dans les cellules Ba/F3 et K562 exprimant Bcr-Abl1. [1] Une étude récente montre qu'il présente une sélectivité pour l'inhibition de la croissance des cellules Bcr-Abl-positives par son inhibition marquée des lignées cellulaires de LMC par rapport aux lignées de leucémie non LMC. [2]

Dosage des isoformes de la kinase Abl1 et détermination de la puissance de l'inhibiteur

L'activité de u-Abl1native est déterminée en suivant la production d'ADP à partir de la réaction de la kinase par couplage avec le système pyruvate kinase/lactate déshydrogénase. Dans ce dosage, l'oxydation du NADH (mesurée comme une diminution de A340nm) est continuellement surveillée par spectrophotométrie. Le mélange réactionnel final (100 μL, dans une plaque Corning à 384 puits) est préparé comme suit : Un mélange de composants de dosage Abl1 kinase/couplé est préparé contenant de l'u-Abl1 kinase (1 nM), de l'Abltide (EAIYAAPFAKKK, 0,2 mM), du MgCl₂ (9 mM), de la pyruvate kinase (~ 4 unités), de la lactate déshydrogénase (~ 0,7 unités), du phosphoénolpyruvate (1 mM) et du NADH (0,28 mM) dans 90 mM Tris contenant 0,1 % d'octyl-glucoside et 1 % de DMSO, pH 7,5. Séparément, un mélange d'inhibiteur est préparé contenant Rebastinib (DCC-2036) dilué en série 3 fois dans du DMSO, puis dilué dans un tampon composé de 180 mM Tris, pH 7,5, contenant du MgCl₂ (18 mM) et 0,2 % d'octyl-glucoside. Cinquante μL du mélange d'inhibiteur sont mélangés avec 50 μL du mélange de composants de dosage Abl1 kinase/couplé ci-dessus, qui est ensuite incubé à 30 °C pendant 2 heures avant l'ajout de 2 μL d'ATP 25 mM (500 μM, final) pour démarrer la réaction. La réaction est enregistrée toutes les 2 minutes pendant 2,5 heures à 30 °C sur un lecteur de plaques Polarstar Optima ou Synergy2. La vitesse de réaction (pente) est calculée en utilisant l'intervalle de temps de 1 à 2 heures avec le logiciel du lecteur. Le pourcentage d'inhibition est obtenu par comparaison de la vitesse de réaction avec celle d'un contrôle DMSO. Les valeurs d'IC50 sont calculées à partir d'une série de pourcentages d'inhibition déterminés à différentes concentrations d'inhibiteur à l'aide de GraphPad Prism. Le dosage de la kinase pour Abl1T315I, p-Abl1native ou Abl1H396P est effectué de la même manière que ci-dessus, sauf que 2,2 nM Abl1T315I, 1 nM p-Abl1 native ou 1,3 nM Abl1H396P est utilisé. Le format de dosage ci-dessus est également utilisé pour les kinases autres que Abl1 à l'exception de TIE2, pour lequel un format de polarisation de fluorescence/Transcreener est utilisé. Les conditions de dosage sont les mêmes que celles décrites ci-dessus, sauf que le PolyE4Y (final 1 mg/mL) est utilisé comme substrat et qu'une préincubation d'une heure est utilisée.

Dans un modèle d'allogreffe de souris portant des cellules leucémiques Ba/F3-Bcr-Abl1T315I, le traitement avec Rebastinib (DCC-2036) par gavage oral à 100 mg/kg une fois par jour inhibe efficacement la signalisation Bcr-Abl1 et prolonge significativement la survie des souris. [1]