PNU-120596 AChR modulator

PNU-120596 verhoogt de door agonist (Ach) opgewekte calciumflux die wordt gemedieerd door een gemanipuleerde variant van de menselijke α7 nAChR. Deze verbinding verhoogt de door agonisten (choline en ACh) opgewekte stromen die worden gemedieerd door wild-type receptoren en toont ook een uitgesproken verlenging van de opgewekte respons in de continue aanwezigheid van agonist in Xenopus oöcyten. Het verhoogt de gemiddelde open tijd van de kanalen van α7 nAChRs, maar heeft geen effect op de ionenselectiviteit en relatief weinig, of geen, effect op de unitaire geleidbaarheid. Wanneer toegepast op acute hippocampale plakjes, verhoogt deze chemische stof de frequentie van ACh-opgewekte GABAerge postsynaptische stromen gemeten in piramidale neuronen; dit effect wordt onderdrukt door TTX, wat suggereert dat het de functie moduleert van α7 nAChRs die zich op het somatodendritische membraan van hippocampale interneuronen bevinden. [1] Naast de positieve modulatie van α7 nAChR, induceert deze verbinding een diepgaande vertraging van de desensitisatiekinetiek, waardoor het potentieel voor Ca²⁺-geïnduceerde toxiciteit door overmatige stimulatie van α7 nAChR wordt vergroot. [2] Het veroorzaakt veranderingen in de cysteïnetoegankelijkheid bij de interne bèta-sheet, overgangszone en agonistbindingsplaats tijdens binding aan α7 nAChR. Bindingsplaatsen voor deze chemische stof bevinden zich niet in de agonistbindingsplaatsen en het versterkt de door agonisten opgewekte gating van nicotinereceptoren door conformationele effecten te veroorzaken die vergelijkbaar maar niet identiek zijn aan de gatingconformaties die door Ach worden bevorderd. [3]

Ca²⁺ fluorescentieassay

SH-EP1 menselijke epitheelcellen die een variant van de α7 nAChR (α7^*) tot expressie brengen, worden gekweekt in minimaal essentieel medium (MEM) dat niet-essentiële aminozuren bevat, aangevuld met 10% foetaal runderserum, L-glutamine, 100 U/ml penicilline/streptomycine, 250 ng/mL fungizone, 400 μg/mL hygromycine B en 800 μg/mL geneticine. α7^* is een variant van de menselijke α7 nAChR, met twee puntmutaties in het eerste transmembraandomein (T230P en C241S) die een hoge functionele expressie in SH-EP1 cellen mogelijk maken [Groppi VE, Wolfe ML, Berkenpas MB (2003) U.S. Patent 6,693,172 B1]. Cellen worden gekweekt in een 37 °C incubator met 6% CO₂. Cellen worden getrypsiniseerd en geplateerd in 96-wells platen met donkere zijwanden en heldere bodems met een dichtheid van 2 × 10⁴ cellen/well 2 dagen voor analyse. Cellen worden geladen met een mengsel van Calcium Green-1 AM in watervrij dimethylsulfoxide en 20% pluronic F-127. Dit reagens wordt direct aan het groeimedium van elke well toegevoegd om een uiteindelijke concentratie van 2 μM Calcium Green-1 AM te bereiken. Cellen worden vervolgens gedurende 1 uur bij 37 °C geïncubeerd in de kleurstof en vervolgens vier keer gewassen met Mark's gemodificeerde Earle's gebalanceerde zoutoplossing (MMEBSS) bestaande uit het volgende (in mM): 4 CaCl₂, 0.8 MgSO₄, 20 NaCl, 5.3 KCl, 5.6 D-glucose, 20 Tris-HEPES, en 120 N-methyl-D-glucamine, pH 7.4. Na de vierde cyclus mogen de cellen gedurende ten minste 10 minuten bij 37 °C incuberen. Het uiteindelijke volume MMEBSS in elke well is 100 μL en atropine wordt aan alle wells toegevoegd voor een uiteindelijke concentratie van 1 μM. Een fluorometrische imaging plaatlezer (FLIPR; Molecular Devices, Union City, CA) is ingesteld om Calcium Green te exciteren bij 488 nm met 500 mW vermogen en fluorescentie-emissie van >525 nm te lezen. Een belichting van 0,5 seconden wordt gebruikt om elke well te belichten. Fluorescentie wordt gedetecteerd met een F-stop set van 2.0 of 1.2. Na 30 seconden basislijnregistratie worden testverbindingen aan elke well van een 96-wells plaat toegevoegd in 50 μL van een 3 × stock. In elk experiment worden vier wells gebruikt als vehikel (0.2% DMSO) controles.

Systemische toediening van PNU-120596 (1 mg/kg) aan ratten verbetert het auditieve gating-tekort veroorzaakt door amfetamine, een model dat wordt voorgesteld om een circuitniveauverstoring geassocieerd met schizofrenie te weerspiegelen. [1] Wanneer toegediend vóór Carrageenan, dempt 30 mg/kg van deze verbinding mechanische hyperalgesie en gewichtsdragende tekorten significant gedurende maximaal 4 uur. Deze chemische stof vermindert de door carrageenan geïnduceerde toename van TNF-α- en IL-6-niveaus in het oedeem van de achterpoot; diclofenac verminderde alleen de IL-6-niveaus. Gevestigde mechanische hyperalgesie geïnduceerd door Carrageenan of CFA wordt ook gedeeltelijk omgekeerd door dit middel. [4]