Rebastinib (DCC-2036) Bcr-Abl inhibitor

A conformational control inhibitor of Abl1 and T315I Abl1.

Rebastinib (DCC-2036) vertoont potente remmende activiteiten tegen gezuiverde natieve Abl1 in ongefosforyleerde (u-Abl1^native) en gefosforyleerde (p-Abl1^native) vormen, ongefosforyleerde en gefosforyleerde gatekeeper-mutant Abl1^T315I, en de activeringslusmutant Abl1^H396P op een niet-ATP-competitieve manier met IC50-waarden van respectievelijk 0,8 nM, 2 nM, 1,4 nM, 5 nM en 4 nM. Bovendien remt het ook de Src-familiekinases Src, LYN, FGR en HCK, en de receptor-TK's KDR, FLT3 en TIE2 met IC50-waarden van respectievelijk 34 nM, 29 nM, 38 nM, 40 nM, 4 nM, 2 nM en 6 nM. [1] Deze verbinding vertoont anti-proliferatieve activiteiten tegen Ba/F3-cellen die native of gemuteerde Bcr-Abl1 tot expressie brengen met IC50 variërend van 2 nM tot 150 nM. Bovendien remt het ook de proliferatie van de Ph⁺-cellijn K562 (IC50 5,5 nM) en induceert het potent apoptose in zowel Bcr-Abl1-expresserende Ba/F3- als K562-cellen. [1] Een recente studie toont aan dat het selectiviteit vertoont voor groeiremming van Bcr-Abl-positieve cellen door de duidelijke remming van CML-cellijnen vergeleken met niet-CML-leukemielijnen. [2]

Assay van Abl1-kinase-isoformen en bepaling van remmerpotentie

De activiteit van u-Abl1native wordt bepaald door de productie van ADP uit de kinase-reactie te volgen door koppeling met het pyruvaatkinase/lactaatdehydrogenase-systeem. In deze assay wordt de oxidatie van NADH (gemeten als een afname van A340nm) continu spectrophotometrisch gemonitord. Het uiteindelijke reactiemengsel (100 μL, in een 384-wells Corning-plaat) wordt als volgt bereid: Een Abl1-kinase/gekoppelde assay-componentenmengsel wordt bereid met u-Abl1-kinase (1 nM), Abltide (EAIYAAPFAKKK, 0,2 mM), MgCl₂ (9 mM), pyruvaatkinase (~ 4 eenheden), lactaatdehydrogenase (~ 0,7 eenheden), fosfoenolpyruvaat (1 mM) en NADH (0,28 mM) in 90 mM Tris met 0,1 % octylglucoside en 1 % DMSO, pH 7,5. Afzonderlijk wordt een remmermengsel bereid met Rebastinib (DCC-2036) drievoudig serieel verdund in DMSO, gevolgd door verdunning in een buffer bestaande uit 180 mM Tris, pH 7,5, met MgCl₂ (18 mM) en 0,2 % octylglucoside. Vijftig μL van het remmermengsel wordt gemengd met 50 μL van het bovengenoemde Abl1-kinase/gekoppelde assay-componentenmengsel, dat vervolgens 2 uur bij 30 °C wordt geïncubeerd voordat 2 μL 25 mM ATP (500 μM, finaal) wordt toegevoegd om de reactie te starten. De reactie wordt elke 2 minuten gedurende 2,5 uur bij 30 °C geregistreerd op een Polarstar Optima- of Synergy2-plaatlezer. De reactiesnelheid (helling) wordt berekend met behulp van het tijdsbestek van 1 tot 2 uur met de software van de lezer. Het percentage remming wordt verkregen door de reactiesnelheid te vergelijken met die van een DMSO-controle. IC50-waarden worden berekend uit een reeks percentage remmingswaarden die zijn bepaald bij verschillende remmerconcentraties met behulp van GraphPad Prism. De kinase-assay voor Abl1T315I, p-Abl1native of Abl1H396P wordt op dezelfde manier uitgevoerd als hierboven, behalve dat 2,2 nM Abl1T315I, 1 nM p-Abl1 native of 1,3 nM Abl1H396P wordt gebruikt. Het bovengenoemde assay-formaat wordt ook gebruikt voor andere kinases dan Abl1, met uitzondering van TIE2, waarvoor een fluorescentiepolarisatie/Transcreener-formaat wordt gebruikt. De assay-omstandigheden zijn dezelfde als hierboven beschreven, behalve dat PolyE4Y (finaal 1 mg/mL) als substraat wordt gebruikt en een incubatie van één uur wordt gebruikt.

In een muis-allograftmodel met Ba/F3-Bcr-Abl1T315I-leukemiecellen, remt behandeling met Rebastinib (DCC-2036) via orale gavage van 100 mg/kg eenmaal daags effectief de Bcr-Abl1-signalering en verlengt de overleving van muizen significant. [1]