Anti-DYKDDDDK Tag magnetic beads

Sellecks Is geciteerd door 119 Publicaties

Voordelen

Tijdsbesparing: bespaart 15-30 min vergeleken met agarose kralen.

Eenvoudige bediening: Magnetische scheiding en centrifugatievrij.

Hoge eiwitbeladingscapaciteit.

Hoge specificiteit.

Productvergelijking

Beschrijving

Anti-DYKDDDDK Tag magnetische kralen zijn gebaseerd op hydroxyl magnetische kralen die covalent gekoppeld zijn aan een hoogwaardig recombinant monoklonaal muizenantilichaam. Met een hoge belasting van DYKDDDDK-getagd eiwit (meer dan 0,6 mg eiwit/mL) en hoge specificiteit, wordt het aanbevolen voor co-immunoprecipitatie en eiwitzuivering.

Eigenschappen

Antilichaam isotoop	Recombinant monoklonaal muizenantilichaam
Antilichaamzuivering	Proteïne A gezuiverd
Toepassing	Immunoprecipitatie en eiwitzuivering
Aanbevolen volume	IP: 20 μl kralen voor 200 μl ruwe eiwitoplossing
Bindingscapaciteit	Minimaal 0,6 mg eiwit geëlueerd per ml magnetische kralen
Bindingseigenschappen	Met-N-terminaal DYKDDDDK Tag fusie-eiwit: Met-DYKDDDDK Tag–Eiwit N-terminaal DYKDDDDK Tag fusie-eiwit: DYKDDDDK Tag–Eiwit C-terminaal DYKDDDDK Tag fusie-eiwit: Eiwit-DYKDDDDK Tag

Opslag (vanaf ontvangstdatum)

Bewaren bij 2-8°C gedurende 2 jaar.

Protocol

Voorbereiding van magnetische kralen
1. Suspend de Anti-DYKDDDDK Tag magnetische kralen in de injectieflacon (pipetteer zachtjes 10 keer, niet vortexen). Breng 10 µL (de hoeveelheid kan indien nodig worden op- of afgeschaald) Anti-DYKDDDDK Tag magnetische kralensuspensie over naar een nieuwe buis.
2. Voeg 0,5 ml TBS-buffer (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) toe. Pipetteer zachtjes 5 keer Anti-DYKDDDDK Tag magnetische kralen. Plaats de buis gedurende 1-2 min (kan passend worden verlengd tot 5 minuten) op de magneet om de kralen van de oplossing te scheiden en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap 2 keer.
Opmerking: Bereid alle magnetische kralen samen in één grote buis en verdeel ze vervolgens in aliquots als monsters in batch zijn. Bij het verwijderen van het supernatant, zuig voorzichtig, aangezien overmatig zuigen kan leiden tot verlies van sommige magnetische kralen.
Eiwitbinding
3. Voeg 500 µL celysaat toe aan de gewassen magnetische kralen. Draai de buis voorzichtig gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4°C.
4. Plaats de buis op de magneet om de kralen van de oplossing te scheiden gedurende 1-2 min (kan passend worden verlengd) en breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe buis om te detecteren of DYKDDDDK-tag-eiwit residu is.
Opmerking: Tijdens het bindingsproces heeft het geen invloed op het resultaat als magnetische kralen af en toe samenklonteren.
Magnetisch Wassen
5. Voeg 500 µL PBST toe aan de buis (NaCl 136,89 mM; KCl 2,67 mM; Na2HPO4 8,1 mM; KH2PO4 1,76 mM; 0,5% Tween20), resuspend de magnetische kralen door zachtjes te pipetteren. Draai vervolgens de buis gedurende 5 min. Plaats de buis op de magneet om de kralen van de oplossing te scheiden gedurende 10 sec en verwijder het supernatant.
6. Herhaal stap 5 ongeveer 2 keer. Als de niet-specifieke onzuiverheidseiwitten achterblijven, verleng dan de reinigingstijd, verhoog het aantal reinigingsbeurten of vergroot de detergensconcentratie in de reinigingsoplossing.
Elutie en detectie
Kies verschillende elutiemethoden afhankelijk van het stroomafwaartse gebruik. Voor IP, ga naar stap 7-8. Voor eiwitzuivering, ga naar stap 9-10 voor lage pH-elutie.
Denaturerende elutie (geschikt voor IP-experimenten met Anti-DYKDDDDK Tag kralen):
7. Voor directe detectie van doeleiwitten, voeg 50 µL 1×eiwitmonsterlaadbuffer toe aan de bovengenoemde precipitatie, kook gedurende 5 min, koel af tot kamertemperatuur en plaats vervolgens de buis op de magneet om de kralen van de oplossing te scheiden gedurende 1-2 min (kan passend worden verlengd).
8. Detecteer het supernatant via SDS-PAGE.
Competitieve poly DYKDDDDK Tag polypeptide elutie (Geschikt voor eiwitzuivering met Anti-DYKDDDDK Tag kralen):
9. Voeg de TBS-buffer met 200 µg-1 mg/mL Poly DYKDDDDK Tag Peptide (B23111) toe aan het product van stap 6, en incubeer ze vervolgens op een shaker (4°C) gedurende 2 uur. Over het algemeen is het volume van Poly DYKDDDDK Tag Peptide 5 keer dat van de gel.
10. Plaats de producten van de bovenstaande stap op de magneetscheiding voor magnetische scheiding. Breng het supernatant met het doeleiwit over naar een nieuwe EP-buis. Indien de magnetische kralen opnieuw moeten worden gebruikt, reinig de gel dan met 0,1 M glycine HCl (pH 3,0) en voer recycling uit.
Lage pH-elutie (geschikt voor eiwitzuivering met Anti-DYKDDDDK Tag kralen):
11. Voeg de 0,1 M glycine HCl (pH 3,0) elutiebuffer toe aan het product van stap 6, en incubeer op een shaker gedurende 5 min (de elutietijd moet minder dan 20 min zijn). Over het algemeen is het volume van de elutiebuffer 5 keer dat van de gel.
12. Centrifugeer de producten verkregen uit de bovenstaande stap op 5000 rpm gedurende 30 sec. Breng vervolgens het elutieproduct snel over naar 1 M Tris (pH 8,0) voor neutralisatie totdat de pH bijna neutraal is.

Problemen oplossen

Probleem	Mogelijke oorzaak	Voorgestelde verbetering
Hoge achtergrond	Niet-specifieke binding van eiwitten aan het antilichaam, magnetische kralen of EP-buizen	Voorzuiver lysaat om niet-specifiek bindende eiwitten te verwijderen. Na het suspenderen van kralen voor de laatste wasbeurt, breng het gehele monster over naar een schone EP-buis en voer vervolgens magnetische scheiding uit.
Hoge achtergrond	Wastijden zijn niet voldoende.	Verhoog het aantal wasbeurten. Verhoog de duur van het wassen.
Geen signaal waargenomen.	DYKDDDDK-getagd eiwit wordt niet tot expressie gebracht in het monster.	Zorg ervoor dat het eiwit van interesse de DYKDDDDK Tag-sequentie bevat. Bereid het verse lysaat. Gebruik geschikte protease-remmers.
	Incubatietijden zijn ontoereikend.	Verhoog de incubatietijden.
	Storende stof is aanwezig in het monster.	Het lysaat kan hoge concentraties dithiothreitol (DTT), 2-mercaptoethanol of andere reducerende middelen bevatten. Overmatige detergensconcentratie kan interfereren met de antilichaam-antigeeninteractie.

Bestand downloaden

Manual