PNU-120596 AChR modulator

PNU-120596 verhoogt de door agonist (Ach) opgewekte calciumflux die wordt gemedieerd door een gemanipuleerde variant van de menselijke α7 nAChR. Deze verbinding verhoogt de door agonisten (choline en ACh) opgewekte stromen die worden gemedieerd door wildtype receptoren en toont ook een uitgesproken verlenging van de opgewekte respons in aanwezigheid van de agonist in Xenopus-oöcyten. Het verhoogt de gemiddelde open tijd van het kanaal van α7 nAChR's, maar heeft geen effect op de ionselectiviteit en relatief weinig, of geen, effect op de unitaire geleidbaarheid. Wanneer toegepast op acute hippocampale plakjes, verhoogt deze chemische stof de frequentie van door ACh opgewekte GABAerge postsynaptische stromen gemeten in piramidale neuronen; dit effect wordt onderdrukt door TTX, wat suggereert dat het de functie van α7 nAChR's moduleert die zich bevinden op het somatodendritische membraan van hippocampale interneuronen. [1] Naast de positieve modulatie van α7 nAChR, induceert deze verbinding een diepgaande vertraging van de kinetiek van desensitisatie, wat de potentie van Ca²⁺-geïnduceerde toxiciteit door overmatige stimulatie van α7 nAChR verhoogt. [2] Het veroorzaakt veranderingen in cysteïnetoegankelijkheid bij de binnenste bèta-sheet, de overgangszone en de agonistbindplaats terwijl het bindt aan α7 nAChR. Bindplaatsen voor deze chemische stof bevinden zich niet in de agonistbindplaatsen en het versterkt de door agonist opgewekte gating van nicotinereceptoren door conformationele effecten te bewerkstelligen die vergelijkbaar maar niet identiek zijn aan de gatingconformaties die door Ach worden bevorderd. [3]

Ca²⁺ Fluorescentie Assay

SH-EP1 humane epitheelcellen die een variant van de α7 nAChR (α7^*) tot expressie brengen, worden gekweekt in minimaal essentieel medium (MEM) dat niet-essentiële aminozuren bevat, aangevuld met 10% foetaal runderserum, L-glutamine, 100 U/ml penicilline/streptomycine, 250 ng/ml fungizon, 400 μg/ml hygromycine B en 800 μg/ml geneticine. α7^* is een variant van de menselijke α7 nAChR, met twee puntmutaties in het eerste transmembraandomein (T230P en C241S) die een hoge functionele expressie in SH-EP1-cellen mogelijk maken [Groppi VE, Wolfe ML, Berkenpas MB (2003) U.S. Patent 6,693,172 B1]. Cellen worden gekweekt in een incubator van 37 °C met 6% CO₂. Cellen worden getrypsiniseerd en geplaatst in 96-well platen met donkere zijwanden en heldere bodems met een dichtheid van 2 × 10⁴ cellen/well 2 dagen voor analyse. Cellen worden geladen met een mengsel van Calcium reen-1AM in watervrije dimethylsulfoxide en 20% pluronic F-127. Dit reagens wordt rechtstreeks aan het groeimedium van elke well toegevoegd om een uiteindelijke concentratie van 2 μM Calcium Green-1 AM te bereiken. Cellen worden vervolgens 1 uur geïncubeerd in de kleurstof bij 37 °C en daarna vier keer gewassen met Mark's gemodificeerde Earle's gebalanceerde zoutoplossing (MMEBSS), bestaande uit het volgende (in mM): 4 CaCl₂, 0.8 MgSO₄, 20 NaCl, 5.3 KCl, 5.6 D-glucose, 20 Tris-HEPES, en 120 N-methyl-D-glucamine, pH 7.4. Na de vierde cyclus mogen de cellen minimaal 10 minuten incuberen bij 37 °C. Het uiteindelijke volume MMEBSS in elke well is 100 μL en atropine wordt aan alle wells toegevoegd voor een uiteindelijke concentratie van 1 μM. Een fluorometrische imaging plate reader (FLIPR; Molecular Devices, Union City, CA) is ingesteld om Calcium Green te exciteren bij 488 nm met 500 mW vermogen en fluorescentie-emissie van >525 nm te meten. Een belichting van 0,5 seconden wordt gebruikt om elke well te belichten. Fluorescentie wordt gedetecteerd met een F-stop ingesteld op 2.0 of 1.2. Na 30 seconden basislijnregistratie worden testverbindingen aan elke well van een 96-well plaat toegevoegd in 50 μL van een 3 × stock. In elk experiment worden vier wells gebruikt als vehikel (0,2% DMSO) controles.

Systemische toediening van PNU-120596 (1 mg/kg) aan ratten verbetert het auditieve gating-tekort veroorzaakt door amfetamine, een model dat wordt voorgesteld om een verstoring op circuitniveau geassocieerd met schizofrenie te weerspiegelen. [1] Wanneer toegediend vóór carrageen, vermindert 30 mg/kg van deze verbinding de mechanische hyperalgesie en gewichtsdraagtekorten significant gedurende maximaal 4 uur. Deze chemische stof vermindert de carrageen-geïnduceerde toename van TNF-α- en IL-6-niveaus in het oedeem van de achterpoot; diclofenac verminderde alleen de IL-6-niveaus. Gevestigde mechanische hyperalgesie geïnduceerd door carrageen of CFA wordt ook gedeeltelijk omgekeerd door dit middel. [4]