Allitinib tosylate EGFR remmer

AST-1306 dubbele mutant ook van ErB2 en EGFR T790M/L858R. AST-1306 is ongeveer 500 keer krachtiger dan lapatinib en meer dan 3000 keer selectiever voor ErbB-familiekinasen dan andere kinasefamilies, waaronder PDGFR, KDR en c-Met. AST-1306 zou covalent kunnen binden aan specifieke aminozuurresiduen van EGFR en ErbB2. AST-1306 remt de groei van HIH3T3-EGFR T790M/L858R-cellen significant op een concentratieafhankelijke manier. AST-1306 onderdrukt effectief de EGFR-fosforylering in HIH3T3-EGFR T790M/L858R-cellen. Bovendien blokkeert AST-1306 de groei van NCI-H1975-cellen die de EGFR T790M/L858R-mutatie bevatten, op een concentratieafhankelijke manier. AST-1306 blokkeert ook de fosforylering van EGFR en stroomafwaartse routes. Bovendien remt AST-1306 de EGF-geïnduceerde EGFR-fosforylering in A549-cellen dosisafhankelijk en aanzienlijk. AST-1306 remt de fosforylering van EGFR en ErbB2, en stroomafwaartse signalering in menselijke kankercellen, waaronder A549-cellen, Calu-3-cellen en SK-OV-3-cellen. [1]

Tyrosinekinase assays

De tyrosinekinase-activiteiten worden bepaald in 96-well ELISA-platen, voorbekleed met 20 μg/mL Poly (Glu,Tyr)4:1. Eerst wordt 80 μL van een 5 μM ATP-oplossing, verdund in kinase-reactiebuffer (50 mM HEPES pH 7.4, 20 mM MgCl₂, 0.1 mM MnCl₂, 0.2 mM Na₃VO₄, 1 mM DTT), aan elke put toegevoegd. Verschillende concentraties van AST-1306, verdund in 10 μL van 1% DMSO (v/v), worden vervolgens aan elke reactieput toegevoegd, waarbij 1% DMSO (v/v) als negatieve controle wordt gebruikt. Vervolgens wordt de kinase-reactie geïnitieerd door de toevoeging van gezuiverde tyrosinekinase-eiwitten, verdund in 10 μL van kinase-reactiebufferoplossing. Experimenten bij elke concentratie worden in duplo uitgevoerd. Na incubatie gedurende 60 min bij 37 °C wordt de plaat driemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,1% Tween 20 (T-PBS). Vervolgens wordt 100 μL anti-fosfotyrosine-antilichaam (PY99, 1:500 verdunning), verdund in T-PBS met 5 mg/mL BSA, toegevoegd. Na 30 min incubatie bij 37 °C wordt de plaat driemaal gewassen zoals voorheen. Mierikswortelperoxidase-geconjugeerd geit-anti-muis IgG (100 μL), verdund 1:2000 in T-PBS met 5 mg/mL BSA, wordt toegevoegd. De plaat wordt opnieuw geïncubeerd bij 37 °C gedurende 30 min en vervolgens gewassen met PBS. Ten slotte wordt 100 μL van een oplossing die 0,03% H2O2 en 2 mg/mL o-fenyleendiamine in 0,1 M citraatbuffer, pH 5.5, bevat, toegevoegd en worden monsters bij kamertemperatuur geïncubeerd totdat kleur verschijnt. De reactie wordt beëindigd door de toevoeging van 50 μL 2 M H2SO4, en de plaat wordt afgelezen met behulp van een multi-well spectrofotometer bij 490 nm. De remmingsgraad (%) wordt berekend met de volgende vergelijking: [1-(A490 behandeld /A490 controle)] ×100%. IC50-waarden worden bepaald uit de resultaten van ten minste drie onafhankelijke tests en berekend met de Logit-methode.

Tweemaal daagse orale toediening van AST-1306 resulteert in een drastische preventie van tumorgroei in SK-OV-3- en Calu-3-xenograftmodellen. In SK-OV-3-modellen verdwijnen tumoren bijna volledig na behandeling met AST-1306 gedurende 7 dagen. Daarentegen remt AST-1306 de groei van tumoren in HO-8910- en A549-xenograftmodellen slechts licht. Daarom is de antitumorale werkzaamheid van AST-1306 groter in ErbB2-overexpresserende tumormodellen dan in modellen die lage niveaus van ErbB2 tot expressie brengen. AST-1306 wordt goed verdragen. Lapatinib vertoont antitumorale activiteit in deze ErbB2-overexpresserende tumormodellen, maar AST-1306 is werkzamer dan lapatinib in het SK-OV-3-xenografttumormodel wanneer het in dezelfde dosis en volgens hetzelfde schema wordt toegediend. Bovendien onderdrukt orale toediening van AST-1306 tweemaal daags gedurende 3 weken de tumorgroei in de FVB-2/N^neu-modellen dramatisch. Na behandeling gedurende 11 dagen verdwijnen de tumoren bijna volledig. De lichaamsgewichten van de muizen dalen tijdens de behandeling met minder dan 20%. [1]