Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

Sellecks Is geciteerd door 81 Publicaties

Productvergelijking

Beschrijving

De Mouse Direct PCR Kit biedt een snelle voorbereiding en PCR-amplificatie die specifiek is ontworpen voor muisgenotypering. De Buffer L en Protease Plus verteren muizen Protocol of Selleck Mouse Direct PCR Kit

1. Vergelijking tussen verschillende methoden

Reagens	Prijs ($)	Genotypering Methode
Reagens	Prijs ($)	NaOH-HCL	Proteinase K	Selleck Direct PCR Kit
Lysis Buffer	Sigma, 0.010	+	+	Buffer L
Proteinase K	Sigma P6556, 1U/reaction, 0.034		+	Protease Plus
Phenol Chloroform	Sigma P3803, 200μL/reaction, 0.116	+	+
Alcohols	Sigma I9030, 459836, 0.084	+	+
Taq	NEB M0273X, 1U/reaction, 0.122	+	+	2 x M-PCR OPTI^TM Mix
dNTP	Sigma GE28-4065-64, 0.25mM, 0.066	+	+
MgCL₂, DNA Loading	Sigma, 0.010	+	+
Price ($) /Reaction		0.41	0.44	0.39

2. Vergelijking van PCR-resultaten (wildtype muis)

Comparison of PCR results from wild-type mouse

Rij 1-10 vertegenwoordigt verschillende PCR-primers. Twee ervan dienen als negatieve controles (rij 9 en 10) die alleen banden vertonen bij gebruik van het transgene muismonster. Daarom zorgt de Mouse Direct PCR kit voor een hogere PCR-specificiteit, waardoor het een betrouwbaar product is voor wetenschappelijk onderzoek.

3. Voordelen

Advantages of the Selleck Mouse Direct PCR Kit

Analyse van resultaat:
De Mouse Direct PCR Kit is van toepassing op de voorbereiding van monsters van muizenstaart, oor en teen. Er werd geen significant verschil waargenomen tussen de groepen, die verteren bij 55℃ gedurende 15 min of 30 min. De kit is ook effectief voor de amplificatie van grote fragmenten (bijv. 3Kb).
Opmerking: De primers voor amplificatie van 500bp en 3Kb-fragmenten zijn ontworpen op basis van het muis GAPDH-gen, terwijl de primers voor 1Kb en 2Kb-fragmenten zijn ontworpen op basis van het muis Ppip5k2-gen.

4. Componenten

Complete Kit	B40013 (200 rxns)	B40015 (500 rxns)
Buffer L	20 mL	25 mL x 2
Protease Plus	0.4 mL	1 mL
2 x M-PCR OPTI^TM Mix (Dye Plus)	1 mL x 2	1 mL x 5
User Guide	1	1

Buffer L: Lysebuffer.

Protease Plus: Voor snelle en efficiënte vertering van muizenweefsel in slechts 15 minuten!

2x M-PCR OPTI^TM Mix: Bevat Sellecks handelsmerk en geoptimaliseerde Taq DNA-polymerase, dNTPs, MgCl₂ en reactiebuffer.

Opslag (vanaf ontvangstdatum)

2 x M-PCR OPTI^TM Mix en Protease Plus moeten 2 jaar bij -20°C worden bewaard. Als de PCR Mix frequent wordt gebruikt, kan deze tot 10 dagen bij 4°C worden bewaard.

Buffer L moet bij 4°C worden bewaard.

Protocol

1. Experimenteel protocol

1) Genomische DNA-preparatie
Plaats de muizenstaart, het oor of de teen in een centrifugebuisje van 1,5 mL. Meng grondig 100 μL verse Buffer L met 2 μL Protease Plus voor een enkel monster in een apart buisje. Voeg het protease-mengsel toe aan de muizenweefselbuisjes met het gesneden weefsel erin ondergedompeld, incubeer vervolgens 15 minuten bij 55°C. Na het verteringsproces, incubeer 5 minuten bij 95°C om protease te inactiveren. Het weefsellysaat kan nu worden gebruikt als PCR-template.

2) PCR Genotypering
Voeg gedestilleerd H₂O, primers, template en 2 x M-PCR OPTI^TM Mix toe aan een PCR-buisje volgens de aanbevolen concentraties. Geef het mengsel een snelle spin in de centrifuge en laad het in de PCR-versterker om de amplificatie te starten. Het wordt aanbevolen om de PCR-reactie in een ijstbad voor te bereiden.

PCR Reactiecomponenten	20 μL Reactievolume (μL)	50 μL Reactievolume (μL)
ddH₂O	8	21
Forward Primer (10 μM)	0.5	1
Reverse Primer (10 μM)	0.5	1
Template	1	2
2 x M-PCR OPTI™ Mix	10	25

PCR Stappen	Temperatuur (°C)	Tijd	Cycli
1	94	5 min	1
2	94	20 sec	35
3	50-65	30 sec
4	72	X min (2 kb /min)
5	72	5 min	1
6	12	--	1

Opmerking: Voor het eerste gebruik
1. Alle reagentia in deze kit zijn geoptimaliseerd voor gezamenlijk gebruik en wijzigingen of alternatieve toepassingen zijn verboden.
2. Zorg ervoor dat voor elke stap elk reagens in de kit goed is gemengd voor gebruik.
3. Tijdens de weefselverteringsstap zal het schudden van de buisjes 1-2 keer nuttig zijn om het genomische DNA vrij te maken.
4. Voor de meeste muizenweefselmonsters volstaat een incubatie van 15 minuten bij 55°C voor de extractie van genomisch DNA. Het weefsel kan nog steeds intact lijken, maar de extractie heeft plaatsgevonden.
5. Het geëxtraheerde muizen genomische DNA moet onmiddellijk vóór de PCR-amplificatiestap worden toegepast. Onjuiste langdurige opslag kan leiden tot onbetrouwbare PCR-amplificaties.

Problemen oplossen

Raadpleeg het volgende voor opties voor probleemoplossing wanneer u technische moeilijkheden ondervindt. U kunt ook rechtstreeks contact opnemen met de technische ondersteuning van Selleck.

Probleem	Mogelijke oorzaak/oorzaken	Suggestie(s)
Geen amplificatieproduct in test- of controlemonsters	Amplificatiereactie was onjuist ingesteld	Optimaliseer de juiste reactie-instelling
	Onjuiste opslag heeft geleid tot verlies van activiteit van PCR-reagentia	Vervang alle componenten door verse reagentia
	Primers zijn niet optimaal en zijn niet geannealeerd	Primers opnieuw ontwerpen
Amplificatie werkte in de controlemonsters, maar niet in de testmonsters	Vertering was onvolledig	Verleng de verteringstijd tot 30 minuten bij 55°C
	Monsters werden te lang bewaard en genomisch DNA is afgebroken	Verzamel verse muizenstaartmonsters voor genomische DNA-extractie
	De lysisoplossing werd te lang gemengd met het PCR-mengsel	PCR-reacties moeten binnen 5 uur na toevoeging van de template worden gestart en in de tussentijd bij 4°C worden bewaard
	De hoeveelheid amplificatieproduct was onvoldoende	Verhoog het aantal PCR-cycli naar 35-40 om meer amplificatieproduct te verkrijgen
Niet-specifiek amplificatieproduct(en)	Annealingstemperatuur was te laag	Verhoog de annealingstemperatuur
	Het aantal PCR-cycli was te hoog	Verlaag het aantal cycli naar 30-35
	Primerconcentratie was te hoog	Verlaag de primerconcentratie
	Templateconcentratie was te hoog	Verdun de template in gezuiverd H₂O of TE-buffer

Bestand downloaden

Manual
SDS