Wortmannin (SL-2052)

De remming van MLCK door Wortmannin wordt niet beïnvloed door calmoduline of peptidesubstraat, terwijl het wordt verminderd door een hoge concentratie ATP. Deze verbinding interageert direct met het katalytische domein van MLCK en leidt tot een irreversibel verlies van de enzymactiviteit. Het heeft geen remmende werking op cAMP-afhankelijke proteïnekinase, cGMP-afhankelijke proteïnekinase en calmoduline-afhankelijke proteïnekinase II, en heeft weinig effect op de proteïnekinase C-activiteit. [1]

Deze remmer remt de N-formylmethionyl-leucylfenylalanine (fMLP)-gestimuleerde PtdInsP3 (fosfatidylinositol 3,4,5-trifosfaat) vorming met een IC50 van 5 nM en deze remming wordt volledig opgeheven wanneer voorbehandeld met 100 nM van deze verbinding in humane neutrofielen, met verhoogde PtdInsP2 niveaus en geen effecten op cellulaire PtdInsP en PtdIns gehalten. Het kan oscillerende veranderingen in F-actinegehalte ontwikkelen en remt fMLP-gestimuleerde actinepolymerisatie in neutrofielen niet. [2]

Deze chemische stof remt irreversibel de fosfatidylinositol 3-kinase (PI3-kinase) activiteit door binding aan het 110-kDa eiwit (IC50 van 3 nM) en heeft geen effect op PI4-kinase in RBL-2H3 cellen. Het remt ook de leukotriene afgifte, zonder effect op de activering van de tyrosinekinase Lyn. [3]

Deze verbinding heft de geïnduceerde hexose-opname in geïsoleerde rattenadipocyten bij 0,1 μM volledig op, zonder de gestimuleerde lipolytische activiteit te belemmeren. [4]

Het onderdrukt de geïnduceerde productie van stikstofmonoxide met 50% bij 500 nM in humane navelstrengader endotheelcellen, als reactie op IGF-1. [5]

Deze chemische stof onderdrukt de reparatie van DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB) en heeft geen effect op DSB-niveaus of de kinetiek van enkelstrengsbreuk (SSB)-reparatie in Chinese hamsterovariumcellen bij 50 μM. Het zou ioniserende straling (IR)-geïnduceerde cytotoxiciteit kunnen versterken zonder zelf toxiciteit te vertonen. [6]

Deze remmer remt de activiteit van polo-like kinase (PLK1) met een IC50 van 24 nM in intacte G2/M-gearresteerde cellen. [7]

Het verhoogt Toll-like receptor (TLR)-gemedieerde accumulatie van IL-6 in humane macrofagen met een EC50 van 50 nM. Tegelijkertijd versterkt deze verbinding significant TLR-gemedieerde induceerbare stikstofmonoxide synthase (iNOS) expressie en nitrietaccumulatie in muizen macrofagen. Het activeert de nucleaire factor-κB en reguleert de cytokine mRNA productie opwaarts. [8]

Deze chemische stof remt ook Polo-like kinase (PlK) 1 en PlK3, die belangrijke rollen spelen bij mitose. De behandeling ervan kan leiden tot een vermindering van de fosforylering van p53 op serine 20 geïnduceerd door DNA-schade. [9]

Het onderdrukt hyaluronan-geïnduceerde Akt-fosforylering en celmotiliteit/migratie in SW1990-cellen. [10]

Wortmannin remt peritoneale metastase van SW1990 bij muizen met 1 mg/kg, zonder gewichtsverlies. [10]

Deze verbinding remt fosfatidylinositol 3-kinase-proteïnekinase B (PKB)/Akt fosforylatie in zowel normale weefsels (long-, hart- en hersenhomogenaten) als tumorweefsel bij muizen, zonder mortaliteit of acute toxiciteit bij 0,7 mg/kg. In combinatie met LY188011 verhoogt deze chemische stof significant de apoptose en remt de tumorgroei in orthotopische tumoren, terwijl beide monotherapieën dat niet konden. [11]

• MLCK-assay

  MLCK-activiteit wordt gemeten met peptidesubstraat (KKRPQRATSNVFS-NH₂) of myosine lichte keten. Het peptidesubstraat (24 μM) wordt gefosforyleerd in een reactiemengsel dat 25 mM Tris-HC1 (pH 7,5), 0,5 mg/mL runderserumalbumine, 4 mM MgCl₂, 0,5 mM CaCl₂, 2,6 nM calmoduline, 1,5 nM MLCK en 400 μM ATP bevat in een eindvolume van 0,25 mL. Na een 10 minuten durende pre-incubatie bij 28 ºC zonder ATP, wordt de reactie gestart door toevoeging van ATP bij 28 ºC en beëindigd door de toevoeging van 0,1 mL 10% (v/v) azijnzuur na 30 minuten. Het mengsel wordt geanalyseerd met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie: kolom, Unisil Pack 5C18 4,6 X 150 mm; oplosmiddel, 18% (v/v) acetonitril, 0,1% (v/v) trifluorazijnzuur in water; stroomsnelheid, 1,0 mL/min; temperatuur, 40 ºC; detectie, absorptie bij 220 nm. Het percentage reactie wordt berekend uit de verhouding van de piekgebieden van de gefosforyleerde vorm tot die van de niet-gefosforyleerde vorm. De specifieke activiteit gemeten onder de hierboven beschreven omstandigheden is 0,81 μmol/min/mg. Myosine lichte keten (108 μg/mL) wordt gefosforyleerd in een reactiemengsel dat 25 mM Tris-HC1 (pH 7,5), 0,5 mg/mL runderserumalbumine, 4 mM MgCl₂, 0,5 mM CaCl₂, 4,2 nM calmoduline, 0,92 nM enzym en 10 μM [γ-³²P]ATP (100-900 cpm/pmol) bevat in een eindvolume van 0,25 mL. Na een 3 minuten durende pre-incubatie bij 30 ºC zonder ATP, wordt de reactie gestart door de toevoeging van [γ-³²P]ATP bij 30 ºC en gestopt door de toevoeging van 0,125 mL trichloorazijnzuur na 5 minuten. De zuur-precipiteerbare materialen worden verzameld op een nitrocellulosemembraanfilter en gewassen met vier aliquots van 1 mL 5% (v/v) trichloorazijnzuur. De radioactiviteit op het filter wordt gemeten in een tolueenscintillatievloeistof, met behulp van een Packard Tri-Carb vloeistofscintillatiespectrometer Model 4530. De specifieke activiteit gemeten onder deze omstandigheden is 1,23 μmol/min/mg. [1]

• Cellijnen

  NK cells

• Concentraties

  1 μM

• Incubatietijd

  1 h

• Methode

  Primary NK cells were pretreated with wortmannin (1 μM) for 1 h, washed twice with RPMI 1640, and then treated with IL-15 (10 ng/mL) for 24 h. DMSO was used as control.

• Dierlijke modellen

  Human pancreatic adenocarcinoma cells PK1 are injected both s.c. and orthotopically into SCID mice.

• Doseringen

  0.175, 0.35, and 0.7 mg/kg

• Toediening

  Injected by i.v.