Vadimezan (DMXAA)

Gezuiverde DT-diaforase enzymactiviteit wordt gemeten door de reductie van cytochroom c te meten bij 550 nm op een Beckman DU 650 spectrofotometer. Elke assay bevat cytochroom c (70 μM), NADH (variabele concentraties), gezuiverde DT-diaforase (0,032 μg) en menadion (variabele concentraties) in een eindvolume van 1 ml Tris-HCl buffer (50 mM, pH 7,4) met 0,14% BSA. De reactie wordt gestart door de toevoeging van NADH. De reductiesnelheden worden berekend over het initiële deel van de reactiecurve (30 seconden), en de resultaten worden uitgedrukt in μmol cytochroom c gereduceerd/min/mg eiwit met behulp van een molaire extinctiecoëfficiënt van 21,1 mM⁻¹ cm⁻¹ voor gereduceerd cytochroom c. Enzymassays worden uitgevoerd bij kamertemperatuur en alle reacties worden in drievoud uitgevoerd. Remming van de gezuiverde DT-diaforase activiteit wordt uitgevoerd door de opname van Vadimezan (DMXAA) in verschillende concentraties in de reactie, en remmingskenmerken worden bepaald door de concentratie van NADH (constante menadion) of menadion (constante NADH) bij verschillende concentraties van deze verbinding te variëren. K_i-waarden worden verkregen door 1/V uit te zetten tegen. De activiteit van DT-diaforase in DLD-1 cellen wordt bepaald door de dicumarol-gevoelige reductie van DCPIP te meten bij 600 nm. Kortom, DLD-1 cellen in de midden-exponentiële groeifase worden geoogst door afschrapen in ijskoude buffer (Tris-HCl, 25 mM, pH 7,4 en 250 mM sucrose) en gesoniceerd op ijs. Enzymassaycondities zijn 2 mM NADH, 40 μM DCPIP, 20 μL dicumarol (indien nodig) in een eindvolume van 1 ml Tris-HCl (25 mM, pH 7,4) met BSA (0,7 mg/ml). Resultaten worden uitgedrukt als de dicumarol-gevoelige reductie van DCPIP met behulp van een molaire extinctiecoëfficiënt van 21 mM⁻¹ cm⁻¹. Eiwitniveaus worden bepaald met behulp van de Bradford-assay.

DLD-1 and H460 cells

0-2 mM

96 hours

DLD-1 human colon carcinoma and H460 human non-small cell lung carcinoma cells are routinely maintained as monolayer cultures in RPMI 1640 culture medium supplemented with foetal calf serum (10%), sodium pyruvate (2 mM), penicillin/streptomycin (50 IU mL⁻¹/50 μg mL^-1) and l-glutamine (2 mM). Chemosensitivity is assessed using the MTT assay and all assays are performed under aerobic conditions. Briefly, cells are plated into each well of a 96-well culture plate and incubated overnight in an atmosphere containing 5% CO₂. Culture medium is completely removed from each well and replaced with medium containing a range of drug concentrations. In the case of menadione alone, the duration of drug exposure is 1 hour, after which the cells are washed twice with Hanks' balanced salt solution prior to the addition of 200 μL fresh RPMI 1640 medium to each well of the plate. For Vadimezan (DMXAA) alone, the duration of exposure is 3 hours. Following a four-day incubation, cell survival is determined using the MTT assay. For combinations of this compound with menadione, cells are initially set up and a non-toxic (>95% cell survival) concentration of it is selected. Cells are then initially exposed to DMXAA (2 mM) for a period of 2 hours, following which the medium is removed and replaced with medium containing the inhibitor (at a constant concentration of 2 mM) and menadione (at a range of drug concentrations). Following a further 7-hour incubation, cells are washed twice with Hanks' balanced salt solution prior to the addition of growth medium.

Chemical carcinogen (NMU) is injected into female Wistar rats.

≤300 mg/kg

Administered via i.p.