Trametinib (GSK1120212)

Trametinib (GSK1120212) remt de fosforylering van MBP, ongeacht het isotype van Raf en MEK, met IC50-waarden variërend van 0,92 nM tot 3,4 nM. Het vertoont geen remming van de kinaseactiviteiten van c-Raf, B-Raf, ERK1 en ERK2. Bovendien vertoont deze verbinding geen drastische remmende activiteit tegen de andere 98 kinasen. Het vertoont potente remmende activiteit tegen humane colorectale kankercellijnen. HT-29- en COLO205-cellen, die bekend staan om een constitutief actieve B-Raf-mutant te hebben, zijn het meest gevoelig ervoor met IC50 0,48 nM en 0,52 nM, respectievelijk. De cellijnen met een K-Ras-mutatie vertonen een breed scala aan gevoeligheid ervoor met IC50 van 2,2-174 nM. Daarentegen blijken COLO320 DM-cellen, die het wild-type gen hebben in zowel B-Raf als K-Ras, resistent te zijn, zelfs bij 10 μM. Behandeling gedurende 24 uur induceert celcyclusarrest in de G1-fase in alle gevoelige cellijnen. Consistent leidt het tot opregulatie van p15^INK4b en/of p27^KIP1 in de meeste colorectale kankercellijnen. Het remt constitutieve ERK-fosforylering in alle gevoelige cellijnen. Deze verbinding induceert apoptosis zowel in HT-29- als in COLO205-cellen, maar COLO205-cellen zijn gevoeliger dan HT-29-cellen wat betreft apoptosis-inductie. [1] Het blokkeert de productie van tumornecrosefactor-α en interleukine-6 uit perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's). [2]

Orale toediening van Trametinib (GSK1120212) in een dosis van 0,3 mg/kg of 1 mg/kg eenmaal daags gedurende 14 dagen is effectief in het remmen van de HT-29 xenograft-groei, en 1 mg/kg van deze verbinding blokkeert de tumorverhoging bijna volledig. De fosforylering van ERK1/2 wordt volledig geremd in de gevestigde tumorweefsels door een enkele orale dosis van 1 mg/kg, en zowel p15^INK4b als p27^KIP1 eiwitniveaus worden opgereguleerd na 14 dagen behandeling. In het COLO205 xenograft-model wordt tumorregressie waargenomen, zelfs bij een dosis van 0,3 mg/kg. Bij een dosis van 1 mg/kg wordt een volledige regressie verkregen bij 4 van de 6 muizen waarbij de tumor degenereert tot het punt dat het tumorvolume niet meetbaar is. [1] Toediening van 0,1 mg/kg onderdrukt bijna volledig adjuvans-geïnduceerde artritis (AIA) en type II collageen-geïnduceerde artritis (CIA) in respectievelijk Lewis-ratten of DBA1/J-muizen. [2]

• Raf-MEK-ERK-cascade-kinase-assay

  Niet-gefosforyleerd myeline basisch eiwit (MBP) wordt gecoat op een ELISA-plaat, en de actieve vorm van B-Raf/c-Raf wordt gemengd met niet-gefosforyleerd MEK1/MEK2 en ERERK2 in 10 μM ATP en 12,5 mM MgCl₂ bevattende MOPS-buffer in aanwezigheid van verschillende concentraties Trametinib (GSK1120212). De fosforylering van MBP wordt gedetecteerd door de anti-fosfo-MBP-antilichaam.

• Cellijnen

  HT-29, HCT-15, HCT116, COLO205, LS-174T, SW480, SW620, T84, LoVo and COLO320

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Incubatietijd

  3 or 4 days

• Methode

  Exponentially growing cells are precultured in 96-well tissue culture plates for 24 hours and then exposed to Trametinib (GSK1120212). Cell growth is determined by an in vitro toxicology assay kit, sulforhodamine B based. For apoptosis assay, both floating and adherent cells are collected and fixed with 70% ethanol. After washing with PBS, the cells are suspended in 100 μg/mL RNase and 25 μg/mL propidium iodide (PI) and incubated at 37 °C for 30 minutes in the dark. The DNA content of each single cell is determined using the flow cytometer Cytomics FC500 or Guava EasyCyte plus.

• Dierlijke modellen

  Female BALB/c-nu/nu mice inoculated subcutaneously with HT-29 or COLO205 cells

• Doseringen

  ~1 mg/kg/day

• Toediening

  Orally