TPCA-1

In een tijdopgeloste fluorescentie resonantie-energieoverdrachtstest remt TPCA-1 de humane IKK-2-activiteit met een IC50 van 17,9 nM. Bovendien blijkt deze verbinding ATP-competitief te zijn. Verder vertoont het IC50-waarden van 400 nM en 3600 nM tegen respectievelijk IKK-1 en JNK3. Deze chemische stof remt de productie van TNF-α, IL-6 en IL-8 op een concentratieafhankelijke manier, met IC50-waarden van respectievelijk 170, 290 en 320 nM. [1] Het remt de proliferatie van gliomacellen, evenals TNF-geïnduceerde RelA (p65) nucleaire translocatie en NFκB-afhankelijke IL8-genexpressie. Belangrijk is dat deze verbinding IFN-geïnduceerde genexpressie remt, waarbij de MX1- en GBP1-genexpressie volledig wordt onderdrukt, terwijl het slechts een gering effect heeft op de ISG15-expressie. [2]

Profylactische toediening van TPCA-1 in doses van 3, 10 of 20 mg/kg, i.p., tweemaal daags (b.i.d.), resulteert in een dosisafhankelijke vermindering van de ernst van murine collageen-geïnduceerde artritis (CIA). De significant verminderde ziekteernst en vertraging van het begin van de ziekte als gevolg van toediening van deze verbinding in een dosis van 10 mg/kg, i.p., tweemaal daags (b.i.d.) zijn vergelijkbaar met de effecten van het antireumatische geneesmiddel, i.p., om de dag. Nucleaire lokalisatie van p65, evenals de niveaus van IL-1beta, IL-6, TNF-alpha en interferon-gamma, zijn significant verminderd in het pootweefsel van muizen behandeld met deze verbinding. Bovendien resulteert in vivo toediening van deze chemische stof in significant verminderde collageen-geïnduceerde T-celproliferatie ex vivo. Therapeutische toediening van deze verbinding in een dosis van 20 mg/kg, maar niet in 3 of 10 mg/kg, i.p., tweemaal daags (b.i.d.), vermindert de ernst van CIA significant. [1]

• IKK-2-test

  Recombinant humaan IKK-2 (residuen 1-756) wordt tot expressie gebracht in baculovirus als een N-terminaal GST-gelabeld fusie-eiwit, en de activiteit ervan wordt beoordeeld met behulp van een tijdopgeloste fluorescentie resonantie-energieoverdrachtstest. Kortom, IKK-2 (5 nM eindconcentratie) verdund in assaybuffer (50 mM HEPES, 10 mM MgCl₂, 1 mM CHAPS, pH 7,4, met 1 mM DTT en 0,01% w/v BSA) wordt toegevoegd aan putjes die verschillende concentraties van deze verbinding of DMSO-voertuig (3% eindconcentratie) bevatten. De reactie wordt geïnitieerd door de toevoeging van GST-IκBα-substraat (25 nM eindconcentratie)/ATP (1 μM eindconcentratie), in een totaal volume van 30 μL. De reactie wordt gedurende 30 min bij kamertemperatuur geïncubeerd en vervolgens beëindigd door de toevoeging van 15 μL 50 mM EDTA. Detectiereagens (15 μL) in buffer (100 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl en 0,1% w/v BSA) dat anti-phosphoserine-IκBα-32/36 monoklonaal antilichaam 12C2, gelabeld met W-1024 europiumchelaat, en een allophycocyanine-gelabeld anti-GST-antilichaam bevat, wordt toegevoegd, en de reactie wordt verder geïncubeerd gedurende 60 min bij kamertemperatuur. De mate van fosforylering van GST-IκBα wordt gemeten als een verhouding van het specifieke 665-nm-energieoverdrachtssignaal tot het referentie-europium 620-nm-signaal, met behulp van een Packard Discovery-plaatlezer.

• Cellijnen

  U87, MT330, SJ-G2, and GBM6 human glioma lines

• Concentraties

  0-50 μM

• Incubatietijd

  3 days

• Methode

  Ten microliters of MTT from stock solution (10 mg/mL) is added to each well of 96-well plates containing glioma cells and incubated at 37 °C for 2–4 h. Oxidized MTT is solubilized by adding 100 μL of 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) in 0.01 N HCL, and plates are incubated at 37 °C for 4 h in a humidified chamber. Plates are read at 570 nm on a plate reader.

• Dierlijke modellen

  Murine collagen-induced arthritis

• Doseringen

  3, 10, or 20 mg/kg

• Toediening

  Administered via i.p. or b.i.d.