Dubermatinib(TP-0903)

In alvleesklierkankercellen (PSN-1) vertoont Dubermatinib (TP-0903) een sterke antiproliferatieve activiteit met een IC50 van 6 M. Het induceert ook een sterke G2/M-arrest door Aurora A en B potent te remmen. [1] In CLL B-cellen van alle patiënten met CLL veroorzaakt deze verbinding een dosisafhankelijke inductie van massale apoptose door zich te richten op gefosforyleerde Axl, en overwint het de CLL BMSC-gemedieerde bescherming van CLL B-cellen tegen apoptose. [2]

In de hippocampus van volwassen ratten verhoogt de intracerebroventriculaire toediening van Dubermatinib (TP-0903) (2,5 nM) het aantal nieuw gegenereerde cellen significant en verlengt het de overleving van hippocampale cellen. [3] Bij muizen voorkomt deze verbinding (20 μg/g, i.p.) effectief GC-geïnduceerde neonatale cerebellaire ontwikkelingsstoornissen. [4]

• Axl Kinase activiteitsassay

  Testverbindingen worden verdund tot de gewenste concentraties in kinase-reactiebuffer (50 mM HEPES pH 7.5, 10 mM MgCl², 1 mM EGTA, 2 mM DTT en 0.01% v/v Tween-20) en worden kort geïncubeerd met Axl kinase. De gebruikte Axl kinase is recombinant humaan Axl kinase (katalytisch domein, aminozuren 473-894) met een histidine-tag. De reactie wordt geïnitieerd door de toevoeging van ATP en gelabeld poly-GT substraat (poly Glu:Tyr, 4:1 polymeer). De concentraties van de verschillende componenten in de assay (10 µL reactievolume) zijn: 1% DMSO, 93 ng/mL Axl kinase, 20 µM ATP en 200 nM poly-GT substraat. Na toevoeging van ATP en poly-GT substraat, is de incubatie 60 min bij kamertemperatuur, de enzymreactie wordt gestopt door toevoeging van 10 µL terbium-gelabeld anti-fosfotyrosine PY20 antilichaam in EDTA-bevattende buffer. De uiteindelijke concentratie van EDTA en antilichaam na toevoeging aan de reactie is respectievelijk 10 mM en 2 nM. Het terbium-geconjugeerde antilichaam genereert een tijdsopgelost FRET-signaal met het molecuul (gebonden aan het poly-GT substraat) wanneer het substraat gefosforyleerd is. Na één uur incubatie bij kamertemperatuur wordt fluorescentie gemeten met excitatie van 320 nm en dubbele emissie van 495 en 520 nm op een EnVision microplaatlezer. Het signaal wordt uitgedrukt in termen van een TR-FRET-ratio (fluorescentie-intensiteit bij 520 nm tot 495 nm).

• Cellijnen

  PSN-1 cells

• Concentraties

  --

• Incubatietijd

  96 hours

• Methode

  For cell proliferation assays with Dubermatinib(TP-0903), 45 µL containing 1000 cells per well are seeded into solid white 384-well plates in appropriate cell growth media containing 10% FBS and incubated overnight at 37 °C and 5% CO₂. The following day, this compound is diluted in serum free growth media to 10x desired concentrations and 5 µL is added to each well. Combined compound and cells are incubated for 96 hours. Following incubation, 40 µL of ATP-Lite solution is added to each well, incubated for an additional 10 minutes at room temperature and luminescence is measured on an EnVision microplate reader. Percent cell viability for it is calculated by comparing treated wells to appropriate controls (e.g. vehicle treated) included on each plate.