EPZ-6438 (Tazemetostat)

Tazemetostat (EPZ-6438) vermindert concentratieafhankelijk de globale H3K27Me3-niveaus in wildtype- of SMARCB1-mutante cellen en induceert sterke antiproliferatieve effecten met IC50 variërend van 32 nM tot 1000 nM in SMARCB1-gedeleteerde MRT-cellijnen. Het induceert genexpressie van neuronale differentiatie en celcyclusinhibitie, terwijl het de expressie van Hedgehog-pathway-genen, MYC en EZH2 remt. [1] Het antiproliferatieve effect van deze verbinding wordt versterkt door NSC-9900 of Hexadecadrol in verschillende EZH2-mutante lymfoomcellijnen. [2]

Bij SCID-muizen met s.c. G401-xenografts induceert Tazemetostat (EPZ-6438) tumorstase gedurende de toedieningsperiode en produceert een significante tumorgoeivertraging met minimale invloed op het lichaamsgewicht. [1]

• Biochemische Methoden

  Tazemetostat (EPZ-6438) wordt gedurende 30 min geïncubeerd met 40 μL per well van 5 nM PRC2 (eindconcentratie in 50 μL is 4 nM) in 1x assaybuffer (20 mM Bicine [pH 7.6], 0,002% Tween-20, 0,005% runderhuidgelatine en 0,5 mM DTT). 10 μL per well van substraatmengsel bestaande uit assaybuffer 3 H-SAM, ongelabeld SAM en peptide dat histon H3 residuen 21-44 bevat met C-terminale biotine (toegevoegd aan een C-terminaal amide-capped lysine) worden toegevoegd om de reactie te starten (beide substraten zijn aanwezig in het uiteindelijke reactiemengsel bij hun respectievelijke Km-waarden, een assayformaat dat wordt aangeduid als ''evenwichtige omstandigheden''). De eindconcentraties van substraten en methyleringsstatus van het substraatpeptide worden voor elk enzym aangegeven. Reacties worden gedurende 90 min bij kamertemperatuur geïncubeerd en afgesloten met 10 μL per well van 600 μM ongelabeld SAM, daarna overgebracht naar een 384-wells flashplate en na 30 min gewassen.

• Cellijnen

  Mutant cell lines (G401, A204, G402, KYM-1), Wild type cell line (RD, 293, SJCRH30)

• Concentraties

  ~10 μM

• Incubatietijd

  7 days

• Methode

  For the adherent cell line proliferation assays, plating densities for each cell line are determined based on growth curves (measured by ATP content) and density over a 7-d time course. On the day before compound treatment, cells are plated in either 96-well plates in triplicate (for the day 0–7 time course) or 6-well plates (for replating on day 7 for the remainder of the time course). On day 0, cells are either untreated, DMSO-treated, or treated with Tazemetostat (EPZ-6438) starting at 10 µM and decreasing in either threefold or fourfold dilutions. Plates are read on day 0, day 4, and day 7 using Cell Titer Glo, with compound/media being replenished on day 4. On day 7, the six-well plates are trypsinized, centrifuged, and resuspended in fresh media for counting by Vi-Cell. Cells from each treatment are replated at the original density in 96-well plates in triplicate. Cells are allowed to adhere to the plate overnight, and cells are treated as on day 0. On days 7, 11, and 14, plates are read using Cell Titer Glo, with compound/media being replenished on day 11. Averages of triplicates are used to plot proliferation over the time course, and calculate IC50 values. For cell cycle and apoptosis, G401 and RD cells are plated in 15-cm dishes in duplicate at a density of 1 × 10⁶ cells per plate. Cells are incubated with this compound at 1 µM, in a total of 25 mL, over a course of 14 d, with cells being split back to original plating density on day 4, 7, and 11. Cell cycle analysis and TUNEL assay are performed using a Guava flow cytometer, following the manufacturer’s protocol.

• Dierlijke modellen

  SCID mice bearing s.c. G401 xenografts.

• Doseringen

  ~500 mg/kg

• Toediening

  Oral administration