MK-8776 (SCH 900776)

MK-8776 (SCH 900776) is een minder potente remmer van Chk2 en CDK2 met een IC50 van respectievelijk 1,5 μM en 0,16 μM. Het vertoont geen significante remming van cytochroom P450 menselijke lever microsomale isovormen 1A2, 2C9, 2C19, 2D6 en 3A4. In combinatie met een antimetaboliet induceert deze verbinding binnen 2 uur accumulatie van γ-H2AX, wat wijst op replicatievorkinstorting en dubbelstrengs DNA-breuken. Bovendien onderdrukt het de accumulatie van de Chk1 pS296 autofosforylatie op een dosisafhankelijke manier. Blootstelling van prolifererende WS1-cellen aan SCH 900776 is geassocieerd met snelle, dosisafhankelijke accumulatie van Chk1 pS345, wat aangeeft dat cyclerende populaties van normale cellen Chk1 pS345 induceren na blootstelling hieraan als onderdeel van een nutteloze cyclus, wellicht aangedreven door AT-familiekinasen en DNA-PK.[1]

Dosisverhoging van MK-8776 (SCH 900776) (16 mg/kg en 32 mg/kg) induceert incrementele verbeteringen in tumorrespons. Belangrijk is dat doses van deze verbinding, die geassocieerd zijn met robuuste biomarkeractivatie en verbeterde tumorrespons, niet geassocieerd zijn met verhoogde toxiciteit op hematologische parameters bij BALB/c-muizen. [1]

• Chk1 SPA-assay

  Een in vitro assay die gebruik maakt van recombinant His-Chk1, uitgedrukt in het baculovirus expressiesysteem als enzymbron, en gebiotinyleerd peptide gebaseerd op CDC25C als substraat. His-Chk1 wordt verdund tot 32 nM in kinasebuffer die 50 mM Tris pH 8,0, 10 mM MgCl₂ en 1 mM DTT bevat. CDC25C (CDC25 Ser216 C-term gebiotinyleerd peptide) peptide wordt verdund tot 1,93 μM in kinasebuffer. Voor elke kinase reactie worden 20 μL van 32 nM Chk1 enzymoplossing en 20 μL van 1,926 μM CDC25C gemengd en gecombineerd met 10 μL van MK-8776 (SCH 900776) verdund in 10% DMSO, wat resulteert in uiteindelijke reactieconcentraties van 6,2 nM Chk1, 385 nM CDC25C en 1% DMSO na toevoeging van de startoplossing. De reactie wordt gestart door toevoeging van 50 μL startoplossing bestaande uit 2 μM ATP en 0,2 μCi ³³P-ATP, wat resulteert in een uiteindelijke reactieconcentratie van 1 μM ATP, met 0,2 μCi ³³P-ATP per reactie. Kinase reacties lopen 2 uur bij kamertemperatuur en worden gestopt door toevoeging van 100 μL stopoplossing bestaande uit 2 M NaCl, 1% H₃PO₄ en 5 mg/mL met streptavidine gecoate SPA-parels. SPA-parels worden opgevangen met behulp van een 96-well GF/B filterplaat en een Filtermate universele harvester. Parels worden tweemaal gewassen met 2 M NaCl en tweemaal met 2 M NaCl met 1% fosforzuur. Het signaal wordt vervolgens gemeten met een TopCount 96-well vloeistofscintillatieteller. Dosis-responscurves worden gegenereerd uit duplo 8-punts seriële verdunningen van deze verbinding. IC50-waarden worden afgeleid door niet-lineaire regressieanalyse.

• Cellijnen

  mESCs

• Concentraties

  10 μM

• Incubatietijd

  1 h

• Methode

  Cells were treated with MK-8776 (SCH 900776), other inhibitors, or vehicle for 1 hour.

• Dierlijke modellen

  Female nude mice injected subcutaneously with A2780 or MiaPaCa2 cells

• Doseringen

  ~50 mg/kg

• Toediening

  Administered intraperitoneally