SB505124

SB505124 wordt geïdentificeerd als een omkeerbare ATP-competitieve en selectieve ALK-remmer van ALK4 en ALK5. Deze verbinding vertoont geen toxiciteit voor renale epitheel A498-cellen bij concentraties tot 100 μM gedurende 48 uur, en blokkeert TGF-β–geïnduceerde apoptose van FaO-cellen en NRP 154-cellen op een concentratie-afhankelijke manier. [1] In menselijke navelstrengader endotheelcellen (HUVEC) blokkeert deze chemische stof (500 nM) de veranderingen van TGF-β1 op F-actine-assemblage en voorkomt het ROS-productie geïnduceerd door TGF-β. [2] Door TGF-beta1-signalering te remmen, leidt dit tot verminderde (DFO)-geïnduceerde neurogenese. [3] Een recente studie toont aan dat deze remmer de migratie en invasie van borstkanker MCF-7-M5-cellen onderdrukt. [4]

In een konijn GFS-model verlaagde SB505124 de intraoculaire druk (IOP) niveaus en verminderde het de subconjunctivale celinfiltratie en littekenvorming op de operatieplaats in de GFS. [5] Bij (TAC)-behandelde muizen en FK12EC KO-muizen voorkomt deze verbinding de activering van endothele TGF-β receptoren en inductie van renale arteriolaire hyalinose. [6]

• In Vitro Proteïnekinase Assay

  Kinase-assays worden uitgevoerd zoals beschreven door Laping et al., 2002, met behulp van het kinase-domein van ALK5 en full-length N-terminaal gefuseerd GST-Smad3. Kinase-assays worden uitgevoerd met 65 nM GST-ALK5 en 184 nM GST-Smad3 in 50 mM HEPES, 5 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 1 mM dithiothreitol en 3 μM ATP. Reacties worden gedurende 3 uur bij 30 °C geïncubeerd met 0,5 μCi [³³P]γATP. Gefosforyleerd eiwit wordt opgevangen op P-81 papier, gewassen met 0,5% fosforzuur en geteld door vloeistofscintillatie. Als alternatief wordt Smad3- of Smad1-eiwit ook gecoat op FlashPlate Sterile Basic Microplates. Kinase-assays worden vervolgens uitgevoerd in FlashPlates met dezelfde assaycondities, waarbij ofwel het kinase-domein van ALK5 met Smad3 als substraat, ofwel het kinase-domein van ALK6 (BMP-receptor) met Smad1 als substraat wordt gebruikt. Platen worden driemaal gewassen met fosfaatbuffer en geteld door TopCount.

• Cellijnen

  A498, FaO and NRP 154 cells

• Concentraties

  0-10 μM

• Incubatietijd

  48 hours

• Methode

  Cell viability is measured as described by Laping et al., 2002 or by using the modified tetrazolium salt WST-1. XTT assay: The cells are serum-deprived for 24 hours and then treated with SB505124 for 48 hours to assess the cellular toxicity. Cell viability is determined by incubating cells for 4 hours with XTT labeling and electron coupling reagent according to the manufacturer's directions. Live cells with active mitochondria produce an orange-colored product, formazan, which is detected using a plate reader at between A450 nm and A500 nm with a reference wavelength greater than 600 nm. The absorbance values correlate with the number of viable cells. Modified tetrazolium salt WST-1: Approximately 2000 cells are seeded in 96-well dishes in 100 μL of 0.2% FBS phenol red-free media overnight. The cells are treated with 50 μL of this compound (to achieve the final concentrations indicated) for 30 minutes before being treated with or without TGF-β1 and TNF-α to a final volume of 200 μL. Cell growth is measured at the indicated time points by incubating each well with 10 μL of WST-1 for 3 hours at 37 °C. Metabolically active cells cleave WST-1 to water-soluble formazan, which is directly quantitated with an enzyme-linked immunosorbent assay plate reader. Each experiment is done at least twice, and treatment for each cell line is done in triplicate.

• Dierlijke modellen

  New Zealand White (NZW) rabbits after glaucoma filtration surgery (GFS).

• Doseringen

  Tablets containing 5 mg of SB505124.

• Toediening

  Administered via p.o.