Rapamycin (Sirolimus)

Rapamycin remt de endogene mTOR-activiteit in HEK293-cellen met een IC50 van ~0,1 nM, krachtiger dan iRap en AP21967 met een IC50 van respectievelijk ~5 nM en ~10 nM. [1] In Saccharomyces cerevisiae induceert deze verbinding een ernstige G1/S-celcyclusarrest en remming van de translatie-initiatie tot niveaus onder 20% van de controle. [2] Het remt significant de cellevensvatbaarheid van T98G en U87-MG op een dosisafhankelijke manier met een IC50 van respectievelijk 2 nM en 1 μM, terwijl het weinig activiteit vertoont tegen U373-MG-cellen met een IC50 van >25 μM, ondanks de vergelijkbare mate van remming van de mTOR-signalering. Deze chemische stof (100 nM) induceert G1-arrest en Autophagy, maar geen apoptose in Rapamycin-gevoelige U87-MG- en T98G-cellen door de functie van mTOR te remmen. [3]

Behandeling met Rapamycin in vivo blokkeert specifiek doelwitten die bekend staan downstream van mTOR te liggen, zoals de fosforylatie en activering van p70S6K en de vrijgave van de remming van eIF4E door PHAS-1/4E-BP1, wat leidt tot een volledige blokkering van de hypertrofische toenames in plantaris spiermassa en vezelgrootte. [4] Kortetermijnbehandeling met deze verbinding, zelfs bij de laagste dosis van 0,16 mg/kg, produceert een diepgaande remming van de p70S6K-activiteit, wat correleert met verhoogde tumorceldood en necrose van de Eker-nier tumoren. [5] Deze chemische stof remt metastatische tumorgroei en angiogenese in CT-26 xenograftmodellen door de productie van VEGF te verminderen en VEGF-geïnduceerde endotheelcelsignalering te blokkeren. [6] Behandeling met deze verbinding bij 4 mg/kg/dag vermindert significant de tumorgroei van C6-xenografts en de tumorvasculaire permeabiliteit. [7]

• Immunoblotting voor de mTOR-kinase-assay

  HEK293-cellen worden gezaaid met 2-2,5×10⁵ cellen/putje van een 12-well plaat en 24 uur serum-gedepriveerd in DMEM. Cellen worden behandeld met toenemende concentraties Rapamycin (0,05-50 nM) gedurende 15 minuten bij 37 °C. Serum wordt toegevoegd tot een finale concentratie van 20% gedurende 30 minuten bij 37 °C. Cellen worden gelyseerd en celysaten worden gescheiden door SDS-PAGE. Opgeloste eiwitten worden overgebracht naar een polyvinylideenfluoride membraan en geïmmunoblotted met een fosfospecifieke primaire antilichaam tegen Thr-389 van p70 S6 kinase. Gegevens worden geanalyseerd met ImageQuant en KaleidaGr

• Cellijnen

  U87-MG, T98G, and U373-MG

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~25 μM

• Incubatietijd

  72 hours

• Methode

  Cells are exposed to various concentrations of Rapamycin for 72 hours. For the assessment of cell viability, cells are collected by trypsinization, stained with trypan blue, and the viable cells in each well are counted. For the determination of cell cycle, cells are trypsinized, fixed with 70% ethanol, and stained with propidium iodide using a flow cytometry reagent set. Samples are analyzed for DNA content using a FACScan flow cytometer and CellQuest software. For apoptosis detection, cells are stained with the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) technique using an ApopTag apoptosis detection kit. To detect the development of acidic vesicular organelles (AVO), cells are stained with acridine orange (1 μg/mL) for 15 minutes, and examined under a fluorescence microscope. To quantify the development of AVOs, cells are stained with acridine orange (1 μg/mL) for 15 minutes, removed from the plate with trypsin-EDTA, and analyzed using the FACScan flow cytometer and CellQuest software. To analyze the autophagic process, cells are incubated for 10 minutes with 0.05 mM monodansylcadaverine at 37 °C and are then observed under a fluorescence microscope.

• Dierlijke modellen

  Athymic Nu/Nu mice inoculated subcutaneously with VEGF-A-expressing C6 rat glioma cells

• Doseringen

  ~4 mg/kg/day

• Toediening

  Injection i.p.