PP2 (AGL 1879)

PP2 remt Src door te binden aan een gebied van het molecuul dat niet overlapt met het ATP-bindingsdomein. [2] Deze verbinding (20 μM) induceert 40-50% groeiremming van HT29-cellen, deze concentratie vermindert de Src-activiteit al na 1 uur en handhaaft een 35% remming van de Src-activiteit gedurende 2 dagen. Het (100 mM) verlaagt de Src-activiteit van HT29-cellen op een dosisafhankelijke manier. Deze chemische stof (1 mM-100 mM) veroorzaakt een dosisafhankelijke groeiremming van menselijke darmkankercellen (HT29, SW480 en PMCO1), leverkankercellen (PLC/PRF/5, KYN-2, Li7 en HepG2) en borstkankercellen (MCF-7, MDA-MB-468 en BT-474). Het (20 μM) verhoogt de aggregatie significant in de meeste kankercellen (HT29, SW480, PMCO1, PLC/PRF/5, KYN-2, Li7, MCF-7 en MDA-MB-468) op een E-cadherine-afhankelijke manier. Deze verbinding (20 μM) versterkt de E-cadherine-expressie en verhoogt ook sterk de associatie van E-cadherine met het actine-cytoskelet in kankercellen. Het (20 μM) verhoogt de expressie van α-catenine, β-catenine en γ-catenine in HT29-cellen, terwijl in PLC/PRF/5- en MCF-7-cellen het totale eiwitniveau van α-catenine niet verandert, maar de niveaus van β-catenine en γ-catenine licht toenemen. [3] Deze remmer remt de proliferatie van twee baarmoederhalskankercellen (HeLa en SiHa) op een tijd- en dosisafhankelijke manier. Het (10 μM) downreguleert de expressieniveaus van pSrc-Y416, pEGFR-Y845 en -Y1173 in HeLa- en SiHa-cellen. Deze chemische stof (10 μM) zou celcyclusarrest kunnen moduleren door p21(Cip1) en p27(Kip1) in zowel HeLa- als SiHa-cellen op te reguleren en de expressie van cycline A en cycline-afhankelijke kinase-2, -4 (Cdk-2, -4) in HeLa en van cycline B en Cdk-2 in SiHa te downreguleren. [4]

PP2 (5 mg/kg/dag) induceert een zekere vertraging in de groeisnelheid van de primaire tumoren ten opzichte van de controle behandeld met vehikel bij SCID-muizen geïnoculeerd met HT29-cellen in de milt. Deze verbinding induceert een zekere vertraging in de groeisnelheid van de primaire tumoren ten opzichte van de controle behandeld met vehikel bij SCID-muizen geïnoculeerd met HT29-cellen in de milt. Deze chemische stof vermindert significant het relatieve levergewicht en het levermetastasevolume in vergelijking met de controles bij SCID-muizen geïnoculeerd met HT29-cellen in de milt. [3] Met deze verbinding (1,5 mg/kg i.p.) behandelde ratten vertonen een reductie van ongeveer 50% van de infarctgrootte op T2-gewogen MRI en in TTC-kleuring in vergelijking met controles bij ratten met focale ischemische hersenbeschadiging. Deze chemische stof resulteert in een betere neurologische score dan controles bij ratten met focale ischemische hersenbeschadiging. [5]

• Immuuncomplex enzymassays

  Het met zuur behandelde enolase wordt 1:20 verdund met 1× PBS alvorens 100 μL/putje te aliquoteren in een Nunc 96-well hoge eiwitbinding assayplaat. De assayputjes worden vervolgens geaspireerd; geblokkeerd met 0,5% runderserum, 1× PBS gedurende 1 uur bij 37 ℃; en daarna vijf keer gewassen met 300 μL 1× PBS/putje. De bron van Lck is ofwel LSTRA-cellen of Lck uitgedrukt in HeLa-cellen met behulp van een vaccinia-expressiesysteem. FynT wordt uitgedrukt in HeLa-cellen met behulp van het vaccinia-systeem. Cellen (12,5×10⁶/mL) worden gelyseerd in lysisbuffer, en de lysaten worden geklaard door centrifugatie bij 14.000 cpm gedurende 15 min bij 4 ℃ in een Eppendorf-buis. De geklaarde lysaten worden vervolgens geïncubeerd met de juiste anti-kinase antilichaam bij 10 μg/mL gedurende 2 uur bij 4 ℃. Proteïne A-Sepharose-kralen worden toegevoegd aan het antilichaam/lysaat-mengsel bij 250 μL/mL en gedurende 30 min bij 4 ℃ geïncubeerd. De kralen worden vervolgens tweemaal gewassen in 1 mL lysisbuffer en tweemaal in 1 mL kinasebuffer (25 mM HEPES, 3 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂ en 100 μM natriumorthovanadaat) en opnieuw gesuspendeerd tot 50% (w/v) in kinasebuffer. Vijfentwintig microliter van de kralensuspensie wordt toegevoegd aan elk putje van de enolase-gecoate 96-well hoge eiwitbinding plaat, samen met een geschikte concentratie van deze verbinding en [γ-³²P]ATP (25 μL/putje van een 200 μCi/mL oplossing in kinasebuffer). Na incubatie gedurende 20 min bij 20 ℃, wordt 60 μL kokende 2× oplosbuffer met 10 mM ATP aan de assayputjes toegevoegd om de reacties te beëindigen. Dertig microliter van de monsters wordt uit de putjes verwijderd, 5 min gekookt en op een 7,5% SDS-polyacrylamidegel geladen. De gels worden vervolgens gedroogd en blootgesteld aan Kodak X-AR-film. Voor kwantificering worden films gescand met behulp van een Molecular Dynamics laserscanner, en de optische dichtheid van de belangrijkste substraatband, enolase p46, wordt bepaald. In aanvullende experimenten voor het meten van de activiteit van deze chemische stof tegen Lck, wordt de assayplaat gewassen met twee wascycli op een Skatron-harvester met behulp van 50 mM EDTA, 1 mM ATP. Scintillatievloeistof (100 μL) wordt vervolgens aan de putjes toegevoegd, en de ³²P-incorporatie wordt gemeten met behulp van een micro-β-teller.

• Cellijnen

  HT29, SW480, PMCO1, PLC/PRF/5, KYN-2, Li7, HepG2, MCF-7, MDA-MB-468 and BT-474 cell lines

• Concentraties

  ~100 μM

• Incubatietijd

  2 days

• Methode

  Cell viability is determined using an in vitro toxicology assay kit following the manufacturer’s instructions. Cells are seeded in 96-well plates at day 0. Starting at day 1, cells are treated for 2 days with each of a series of increasing concentrations of PP2 (1 μM, 10 μM, and 100 μM). At the end of this period, cell proliferation is evaluated  by mitochondria dehydrogenase in viable cells, leading to formazan formation. This experiment is repeated three times with 10 determinations/tested concentration.

• Dierlijke modellen

  SCID mice inoculated HT29 cells in the spleen

• Doseringen

  5 mg/kg/day

• Toediening

  intraperitoneal injection