BIBF 1120 (Nintedanib)

BIBF1120 remt de PDGFR-kinaseactiviteit van PDGFR alfa- en PDGFR bètatypes met IC50-waarden van respectievelijk 59 nM en 65 nM. Bovendien onderdrukt BIBF1120 de FGFR-subtypen met IC50 van 60 nM, 37 nM en 108 nM voor respectievelijk FGFR1, FGFR2 en FGFR3. BIBF1120 bindt aan de ATP-bindingsplaats in de spleet tussen de amino- en carboxyterminale lobben van het kinase-domein. Het indolinon-skelet vormt twee waterstofbruggen met het ruggengraatstikstof van Cys⁹¹⁹ en het ruggengraatcarbonylzuurstof van Glu⁹¹⁷ in het scharniergebied. BIBF 1120 remt de proliferatie van PDGF-BB-gestimuleerde BRP's met een EC50 van 79 nM in celassays. BIBF1120 in concentraties zo laag als 100 nM blokkeert de activering van MAPK na stimulatie met 5% serum plus PDGF-BB. In culturen van humane vasculaire gladde spiercellen (HUASMC) voorkomt BIBF1120 de PDGF-BB-gestimuleerde proliferatie met een EC50 van 69 nM. [1]

In alle tot nu toe geteste tumormodellen, inclusief humane tumorxenografts die groeien in naakte muizen en een syngene ratten-tumormodel, is BIBF1120 zeer actief bij goed verdraagbare doses (25-100 mg/kg dagelijks p.o.). Dit blijkt uit de magnetische resonantiebeeldvorming van tumorperfusie na 3 dagen, de vermindering van vaatdichtheid en vaatintegriteit na 5 dagen, en een diepgaande groeiremming. [1]

• VEGFR2 Kinase Assay

  Het cytoplasmatische tyrosinekinasedomein van VEGFR2 (residuen 797-1355 volgens de sequentie gedeponeerd in databank SWISS-PROT P35968) wordt gekloneerd in pFastBac gefuseerd aan GST en geëxtraheerd. Enzymactiviteit wordt bepaald in aanwezigheid of afwezigheid van seriële verdunningen van BIBF1120 uitgevoerd in 25% DMSO. Elke microtiterplaat bevat interne controles zoals blanco, maximale reactie en historisch referentieverbinding. Alle incubaties worden uitgevoerd bij kamertemperatuur op een draaischudder. 10 μL van elke BIBF1120-verdunning wordt toegevoegd aan 10 μL verdund kinase (0,8 μg/mL VEGFR2, 10 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA en 2 mg/mL BSA) en 1 uur voorgeïncubeerd. De reactie wordt gestart door toevoeging van 30 μL substraatmengsel bevattende 62,4 mM Tris pH 7,5, 2,7 mM DTT, 5,3 mM MnCl₂, 13,3 mM Mg-acetaat, 0,42 mM ATP, 0,83 mg/mL Poly-Glu-Tyr(4:1), en 1,7 μg/mL Poly-Glu-Tyr(4:1)-biotine en 1 uur geïncubeerd. De reactie wordt gestopt door toevoeging van 50 μL van 250 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,4. 90 μL van het reactiemengsel wordt overgebracht naar een streptavidineplaat en 1-2 uur geïncubeerd. Na drie wassingen met PBS wordt de met EU gelabelde antistof, PY20, toegevoegd (aanbevolen verdunning 1:2000 van 0,5 mg/mL gelabelde antistof in DELFIA assaybuffer). Overtollige detectie-antistof wordt verwijderd door drie wassingen met DELFIA-wasbuffer. Vervolgens, 10 minuten voor meting op de multilabellezer, wordt elke put geïncubeerd met 100 μL DELFIA-versterkingsoplossing.

• Cellijnen

  HUVEC, HUASMC, and BRP cell lines

• Concentraties

  50 nM

• Incubatietijd

  2 hours

• Methode

  The cell lines HUVEC, HUASMC, and BRP are used for the assay. BIBF1120 is added to the cultures two hours before the addition of ligands. Cell lysates are generated. Western blotting is done using standard SDS-PAGE methods, loading 50 to 75 μg of protein per lane. Detection is facilitated by enhanced chemiluminescence. Total and phosphorylated mitogen-activated protein kinase (MAPK) is analyzed using monoclonal antibodies M3807 and M8159. Total Akt is detected using the corresponding polyclonal antibody and phosphorylated Akt (Ser473) is analyzed by using its monoclonal antibody. Monoclonal antibody is also used to detect cleaved caspase-3 while KDR (VEGFR2) protein is detected using a corresponding antibody.

• Dierlijke modellen

  FaDu, Caki-1, SKOV-3, H460, HT-29, or PAC-120 xenografts in Athymic NMRI-nu/nu female mice

• Doseringen

  100 mg/kg

• Toediening

  p.o.