Laduviglusib (CHIR-99021) Hydrochloride

CHIR-99021 vertoont een meer dan 500-voudige selectiviteit voor GSK-3 ten opzichte van zijn nauwste homologen CDC2 en ERK2, evenals andere proteïnekinasen. Bovendien vertoont CHIR-99021 slechts een zwakke binding aan een panel van 22 farmacologisch relevante receptoren en weinig remmende activiteit tegen een panel van 23 niet-kinase-enzymen. CHIR-99021 induceert de activering van glycogeen synthase (GS) in insuline receptor-expresserende CHO-IR-cellen met een EC50 van 0,763 μM. [1] Naast het simuleren van de werking van insuline, verhoogt de remming van GSK-3 door CHIR-99021 (3 μM) het vrije cytosolische β-catenine met 1,9-voudig, wat de canonieke Wnt-signaalroute in 3T3-L1 preadipocyten nabootst. Tijdens een van de eerste 3 dagen van differentiatie remt CHIR-99021-behandeling de preadipocytdifferentiatie met een IC50 van 0,3 μM door de inductie van CCAAT/enhancer-binding protein α (C/EBPα) en peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) te blokkeren. [2] In tegenstelling tot lithiumchloride en AR-A014418 vermindert CHIR-99021-behandeling de levensvatbaarheid van INS-1E-cellen niet, zelfs niet bij hoge concentraties. In plaats daarvan verhoogt CHIR-99021 robuust de proliferatiesnelheid van INS-1E-cellen op een dosisafhankelijke manier en remt het significant de INS-E-celdood die wordt veroorzaakt door hoge glucose en hoog palmitaat op een concentratieafhankelijke manier. CHIR-99021 bevordert de replicatie van primaire bètacellen in geïsoleerde ratteneilandjes bij concentraties zo laag als 1 μM, met een 2-3 voudige toename van de celreplicatie bij 5 μM CHIR-99021-behandeling. [3]

Orale toediening van CHIR-99021 bij 30 mg/kg verbetert de glucosemetabolisme in een knaagdiermodel van type 2 diabetes, met een maximale plasmaglucosereductie van bijna 150 mg/dl 3-4 uur na toediening, terwijl de plasma-insuline op of onder controleniveaus blijft. Orale toediening van CHIR-99021 bij 16 of 48 mg/kg 1 uur vóór orale glucosetests bij ZDF-ratten verbetert de glucosetolerantie significant met respectievelijk 14% en 33% reductie van de plasmaglucose bij 16 mg/kg en 48 mg/kg, en de hogere dosis CHIR-99021 vermindert ook hyperglykemie vóór de orale glucosetest. [1]

• Celvrije kinase assays

  Polypropyleen 96-wells platen worden gevuld met 300 μL/well buffer (50 mM tris HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol, 25 mM β-glycerofosfaat, 1 mM NaF, 0.01% BSA, pH 7.5) met daarin 27 nM GSK-3α of 29 nM GSK-3β, en 0.5 μM biotine-CREB peptide substraat. Verschillende concentraties CHIR-99021 worden toegevoegd in 3.5 μL DMSO, gevolgd door 50 μL ATP-stock om een uiteindelijke concentratie van 1 μM ATP te verkrijgen in alle celvrije assays. Na incubatie worden drievoudige 100 μL aliquots overgebracht naar Combiplate eight platen die 100 μL/well 50 μM ATP en 20 mM EDTA bevatten. Na 1 uur worden de wells vijfmaal gespoeld met PBS, gevuld met 200 μL scintillatievloeistof, afgesloten, 30 minuten gelaten en geteld in een scintillatieteller. Alle stappen worden bij kamertemperatuur uitgevoerd.

• Cellijnen

  INS-1E

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~ 20 μM

• Incubatietijd

  1, or 4 days

• Methode

  Cells are maintained for 24 hours in starvation medium (culture medium with only 5 mM glucose, 1% fetal calf serum). Then cells are exposed to various concentrations of CHIR-99021 for 1, or 4 days. Cell number is measured by staining of cellular DNA with CyQuant dye, which becomes fluorescent when bound to DNA. Fluorescence is measured after 30 minutes of incubation using the FLUOstar Optima reader. Cell replication is determined by BrdUrd incorporation. BrdUrd labeling solution is added to the medium for the last 4 hours before the cells are fixed using FixDenat solution and incubated with monoclonal anti-BrdUrd-POD antibodies. After substrate solution is added to each well, the light emission is measured in a microplate luminometer using the Analyst HT detection system.

• Dierlijke modellen

  Female db/db mice or male ZDF rats with type 2 diabetes

• Doseringen

  ~48 mg/kg

• Toediening

  Orally