JIB-04

Actieve JMJD2E aa 1-350 wordt gezuiverd uit E. coli en in vitro gebruikt in aanwezigheid van α-ketoglutaraat, 5-10 μM ijzer, ascorbinezuur en een histonpeptide-substraat in een gekoppelde reactie met formaldehyde dehydrogenase aangevuld met NAD+ om NADH-productie te kwantificeren of met behulp van Epigentek kit P-3081. Voor histon-demethyleringsreacties gekwantificeerd door Western-analyse, wordt een His-getagd hJMJ2D aa 1-350 expressieconstruct, het vriendelijke geschenk van Drs. Y. Shi en J. Whetstine, tot expressie gebracht en gezuiverd uit E. coli volgens de instructies van de Qiagen Ni-NTA agarose handleiding en het protocol van Whestine et al 54. Kortom, het eiwit wordt geëlueerd in 50 mM TrisHCl pH 7.8 + 0.3 M NaCl + 10% Glycerol + 200 mM immidazol, en gedialyseerd tegen 20 mM TrisHCl pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.2 mM PMSF, 0.5 mM DTT, 8% glycerol. Enzym wordt gealiquoteerd, snel bevroren en opgeslagen bij -80°C. Voor activiteitsassays door Western blot worden ~1.5 μg enzym gecombineerd met 0.3 μg H3K9me3-substraat (Active Motif #31213) in 10 μM (NH₄)₂Fe(SO₄)₂, 1 mM α-ketoglutaraat en 2 mM natrium-L-ascorbaat in 50 mM Hepes pH 7.9 in aanwezigheid van vehiculum of medicijn en geïncubeerd gedurende 30 min-2 uur bij 37°C. SDS-ladingsbuffer wordt toegevoegd aan de reacties, en na koken worden monsters uitgevoerd op NuPage 4-12% Bis-Tris gels, overgebracht naar nitrocellulose en geblot met Upstate #07-523 om H3K9me3 te detecteren. Voor de detectie van H3 totaal signaal gebruiken we Active Motif #39763 (primair) en IRDye 680 geconjugeerd ezel anti-konijn IgG (secundair, LI-COR # 926-32223) en werden blots gebeeld in een Odyssey infrarood imaging systeem, vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr. M. Cobb. Voor in vitro IC50-bepalingen en competitie studies, worden typisch 100-200 ng gezuiverd eiwit geïncubeerd met vehiculum, JIB-04 of analogen, zoals aangegeven in figuurlegendes en activiteit gemeten door ELISA (Epigentek kit P-3081 voor H3K9me3 demethylatie, P-3083 voor H3K4me3 demethylatie, en P-3085 voor H3K27me3 demethylatie) in reacties die 50mM Hepes pH 7.5, 0.01% Tween 20, 120nM (NH₄)₂Fe(SO₄)₂, 1 mM α-ketoglutaraat, 2 mM natrium-L-ascorbaat en 50ng peptide substraat bevatten. De uiteindelijke enzymconcentraties in de reacties waren als volgt: 206 nM JMJD2A, 12 nM JMJD2B, 60 nM JMJD2C, 90 nM JMJD2D E.coli, 30 nM JMJD2D Sf9, 30 nM JMJD2E, 30 nM Jarid1a, 35 nM JMJD3. Achtergrondmetingen worden verkregen met door warmte geïnactiveerde enzymen, 0.5-1 mM 2,4 PDCA of reacties zonder 2-OG. hJMJD2A (aa1-350) gezuiverd in E.coli is het vriendelijke geschenk van Dr. Jose Rizo-Rey en wordt getest met 400 ng/reactie vanwege de intrinsieke lage activiteit. GraphPad Prism software wordt gebruikt voor IC50-berekeningen en curve-fitting. E.coli JMJD2D gezuiverd door ons en Sf9 JMJD2D van BPS gaven ononderscheidbare resultaten. Merk op dat voor substraatcompetitie-assays, om in het lineaire bereik van de assay te blijven en de bindingscapaciteit van de ELISA-plaat niet te verzadigen, reacties met > 0.75 μM H3K9me3 ongebiotinyleerd substraat bevatten of verdund worden in de detectiestap en signalen worden aangepast per verdunningsfactor. Voor de directe kwantificatie van H3K9me3 demethylase-activiteit in cellysaten, werden behandelde cellen (geplateerd met 2 miljoen/10cm schaal) of tumorhomogenaten in PBS gesonificeerd (3x 4 sec) en werden gelijke hoeveelheden eiwit geïncubeerd met een histon H3K9me3-substraat in een reactiebuffer die cofactoren bevatte gedurende 2 uur bij 37°C vóór specifieke immuun-detectie van het H3K9me2-product met Epigentek kit P-3081 reagentia. 500 ng E.coli gezuiverd PHD2-eiwit in 40mM Tris pH 7.4, 100mM NaCl, 20% glycerol, 5mM β-mercapto-ethanol, 10mM maltose wordt gebruikt om activiteit in het lineaire bereik te verkrijgen. Biotinyleerde peptiden afgeleid van de HIF-1 ODD (Biotin-Acp-DLDLEALAPYIPADDDFQL of Biotin-Acp-DLDLEALAP(OH)YIPADDDFQL als gehydroxyleerde controle) worden geïmmobiliseerd op Neutravidin-gecoate 96-well platen. Enzym wordt geïncubeerd in de gecoate wells in reactiebuffer (20 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 0.12 μM ijzersulfaat, 0.5 mM 2-oxoglutaraat en 1 mM ascorbaat) gedurende 45 min bij kamertemperatuur in aanwezigheid van de aangegeven medicijnen. Het competitieve analogon van α-ketoglutaraat, DMOG, wordt gebruikt als positieve controle voor inhibitie. Peptidehydroxylering wordt gedetecteerd met behulp van een polyclonaal konijnenantilichaam gericht tegen een gehydroxyleerd HIF-peptide-epitoop (konijnen anti-hydroxyproline 4817, in eigen huis gemaakt), gevolgd door toevoeging van een geit anti-konijn HRP-geconjugeerd secundair antilichaam. Luminescentie wordt gemeten in een EnVision plaatlezer. De activiteit van LSD1 recombinant eiwit wordt gemeten met behulp van Epigentek kit P-3075 volgens het protocol van de fabrikant met de gepatenteerde remmer.

Human lung cancer cell lines (LCa), primary or immortalized non-tumorigenic HBECs, prostate cancer (PCa), primary prostate stromal (PrSC) and prostate epithelial cells (PrEC).

~10 μM

96 hours

For cell viability assays, cells are plated at 1500-3000 cells/well in 96 well plates and treated the next day with increasing doses of this compound over 4 days and their viability assessed by standard MTS assays using Promega’s Cell Titer or Cell Titer-Glo reagents according to the manufacturer’s protocols. Absorbance at 490 nm and 650 nm or luminescence is measured by a Spectra Max or a FlouroStar Omega plate reader. Data are normalized to the untreated controls (100% viability). Each cell line is tested in 2-5 independent assays, each containing 4-8 replicates. IC50 values are calculated using DIVISA, a high-throughput software, developed in hous, for storing and analyzing drug sensitivity assays. Dose-response curves are plotted using a non-linear regression model and IC50s are determined from the fitted curves. The average IC50 derived from 2-5 independent assays, each containing 4-8 replicates is reported.

Mice harboring H358 xenografts or A549 xenografts

110 mg/kg (H358, i.p.), 55 mg/kg (A549, Oral gavage)

Oral gavage or i.p.