Datasheet

Biologische Beschrijving

Specificiteit	HACE1 Antibody [A17B18] herkent endogene niveaus van totaal HACE1-eiwit.
Achtergrond	Het HACE1 (HECT domain and ankyrin repeat-containing E3 ubiquitin-protein ligase 1) gen bevindt zich op chromosoom 6 en codeert voor een eiwit bestaande uit 909 aminozuren. HACE1 wordt sterk tot expressie gebracht in diverse menselijke weefsels, waaronder het hart, de hersenen, de placenta, de alvleesklier en zowel foetale als volwassen nieren. HACE1 mRNA wordt ubiquitair tot expressie gebracht in normale menselijke weefsels. Verlaagde expressieniveaus van HACE1 zijn sterk geassocieerd met hypermethylering van twee CpG-eilanden die stroomopwaarts van het genlocus liggen, wat suggereert dat epigenetische regulatie een rol speelt in de silencing ervan. HACE1 is vaak neerwaarts gereguleerd in verschillende soorten kanker, waaronder natural killer/T-cel lymfoom (NKTCL), colorectale kanker en maagkanker. Subcellulair lokaliseert HACE1 zich voornamelijk in het endoplasmatisch reticulum en het cytosol, hoewel doorgaans slechts lage niveaus van endogeen eiwit worden gedetecteerd. Functioneel werkt HACE1 als een E3 Ligase en werkt samen met het E2-enzym UBCH7 om de ubiquitinatie van doelwiteiwitten te katalyseren. Het is met name betrokken bij fosforylering-afhankelijke afbraak van cycline D1, waardoor het een rol speelt in het remmen van de celcyclusprogressie. HACE1 bindt ook bij voorkeur aan de actieve, GTP-gebonden vorm van het kleine GTPase Rac1 en bevordert de polyubiquitinatie ervan. Deze activiteit is essentieel voor Rac1-afbraak als reactie op cytotoxische necrotiserende factor 1 (CNF1), vergemakkelijkt bacteriële invasie van endotheelcelmonolagen, en benadrukt een rol voor HACE1 in aangeboren immuunverdedigingsmechanismen. Verlies van HACE1 leidt tot de spontane ontwikkeling van laat optredende tumoren, wat de functie als tumorsuppressor verder ondersteunt. Het gen bevindt zich binnen de chromosomale regio 6q21, een hotspot die betrokken is bij meerdere menselijke kankers, wat de klinische significantie in tumorigenese onderstreept.

Specificiteit

HACE1 Antibody [A17B18] herkent endogene niveaus van totaal HACE1-eiwit.

Achtergrond

Het HACE1 (HECT domain and ankyrin repeat-containing E3 ubiquitin-protein ligase 1) gen bevindt zich op chromosoom 6 en codeert voor een eiwit bestaande uit 909 aminozuren. HACE1 wordt sterk tot expressie gebracht in diverse menselijke weefsels, waaronder het hart, de hersenen, de placenta, de alvleesklier en zowel foetale als volwassen nieren. HACE1 mRNA wordt ubiquitair tot expressie gebracht in normale menselijke weefsels. Verlaagde expressieniveaus van HACE1 zijn sterk geassocieerd met hypermethylering van twee CpG-eilanden die stroomopwaarts van het genlocus liggen, wat suggereert dat epigenetische regulatie een rol speelt in de silencing ervan. HACE1 is vaak neerwaarts gereguleerd in verschillende soorten kanker, waaronder natural killer/T-cel lymfoom (NKTCL), colorectale kanker en maagkanker. Subcellulair lokaliseert HACE1 zich voornamelijk in het endoplasmatisch reticulum en het cytosol, hoewel doorgaans slechts lage niveaus van endogeen eiwit worden gedetecteerd. Functioneel werkt HACE1 als een E3 Ligase en werkt samen met het E2-enzym UBCH7 om de ubiquitinatie van doelwiteiwitten te katalyseren. Het is met name betrokken bij fosforylering-afhankelijke afbraak van cycline D1, waardoor het een rol speelt in het remmen van de celcyclusprogressie. HACE1 bindt ook bij voorkeur aan de actieve, GTP-gebonden vorm van het kleine GTPase Rac1 en bevordert de polyubiquitinatie ervan. Deze activiteit is essentieel voor Rac1-afbraak als reactie op cytotoxische necrotiserende factor 1 (CNF1), vergemakkelijkt bacteriële invasie van endotheelcelmonolagen, en benadrukt een rol voor HACE1 in aangeboren immuunverdedigingsmechanismen. Verlies van HACE1 leidt tot de spontane ontwikkeling van laat optredende tumoren, wat de functie als tumorsuppressor verder ondersteunt. Het gen bevindt zich binnen de chromosomale regio 6q21, een hotspot die betrokken is bij meerdere menselijke kankers, wat de klinische significantie in tumorigenese onderstreept.

Gebruiksinformatie

Toepassing

WB

Verdunning

WB

1:1000 - 1:10000

Reactiviteit

Mouse, Rat, Human

Bron

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

102 kDa

Opslagbuffer

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

Opslag
(Vanaf de datum van ontvangst)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

Experimentele Methoden
WB	Experimental Protocol: Sample preparation 1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature. 2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min. 4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant; 5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration; 6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice. Electrophoretic separation 1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 5%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations 2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.) Transfer membrane 1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter; 2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer; 3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip"; 4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min. ( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.) Block 1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes; 2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature; 3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time. Antibody incubation 1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight; 2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time; 3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour; 4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time. Antibody staining 1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly; 2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Experimentele Methoden

WB

Experimental Protocol:

Sample preparation

1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature.

2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Lyse the cells by adding an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail) and put the sample on ice for 5 min.

4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant;

5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration;

6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice.

Electrophoretic separation

1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 5%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations

2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.)

Transfer membrane

1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter;

2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer;

3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip";

4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications

Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min.

( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.)

Block

1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes;

2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature;

3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time.

Antibody incubation

1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:1000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight;

2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time;

3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour;

4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time.

Antibody staining

1. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly;

2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system.

Referenties

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34815381/
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38364733/

Toepassingsgegevens

WB

Gevalideerd door Selleck

Lane 1: HEK293, Lane 2: SH-SY5Y, Lane 3: Mouse brain, Lane 4: Rat brain