Datasheet

Biologische Beschrijving

Specificiteit	GCLC Antibody [C5F2] herkent endogene niveaus van totaal GCLC-eiwit.
Achtergrond	Glutamaat-cysteïne ligase katalytische subeenheid (GCLC) is een sleutelenzym betrokken bij de biosynthese van Glutathione (GSH), een essentieel antioxidant dat cellen helpt beschermen tegen oxidatieve schade en het cellulaire redoxevenwicht handhaaft. GCLC maakt deel uit van een heterodimeer enzymcomplex, GCL, bestaande uit GCLC en de modifier subeenheid GCLM. Het enzym heeft een sterk geconserveerde actieve plaats die verantwoordelijk is voor het katalyseren van de eerste en snelheidsbeperkende stap in GSH-synthese, waarbij de ligatie van glutamaat en cysteïne plaatsvindt om γ-glutamylcysteïne te vormen. De primaire rol is het katalyseren van de vorming van γ-glutamylcysteïne, een voorloper van GSH. Dit proces is essentieel voor cellulaire verdediging tegen oxidatieve stress, ontgifting en het handhaven van intracellulaire redoxhomeostase. GCLC reguleert, in combinatie met GCLM, de snelheid van GSH-productie, waardoor het een cruciaal enzym is voor het handhaven van een goede cellulaire functie. De GCLC-activiteit wordt strak gereguleerd door de interactie met GCLM. GCLM verbetert de katalytische efficiëntie van GCLC, en de enzymactiviteit kan worden gemoduleerd als reactie op oxidatieve stress en veranderingen in metabole toestanden. Bovendien wordt de GCLC-expressie opgereguleerd tijdens oxidatieve stress om te voldoen aan de toegenomen vraag naar GSH. Het is ook betrokken bij ontgifting, modulatie van de immuunrespons en bescherming tegen reactieve zuurstofsoorten (ROS). Dysregulatie van GCLC-activiteit en GSH-productie wordt geassocieerd met neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, waarbij oxidatieve stress een prominent kenmerk is.

Specificiteit

GCLC Antibody [C5F2] herkent endogene niveaus van totaal GCLC-eiwit.

Achtergrond

Glutamaat-cysteïne ligase katalytische subeenheid (GCLC) is een sleutelenzym betrokken bij de biosynthese van Glutathione (GSH), een essentieel antioxidant dat cellen helpt beschermen tegen oxidatieve schade en het cellulaire redoxevenwicht handhaaft. GCLC maakt deel uit van een heterodimeer enzymcomplex, GCL, bestaande uit GCLC en de modifier subeenheid GCLM. Het enzym heeft een sterk geconserveerde actieve plaats die verantwoordelijk is voor het katalyseren van de eerste en snelheidsbeperkende stap in GSH-synthese, waarbij de ligatie van glutamaat en cysteïne plaatsvindt om γ-glutamylcysteïne te vormen. De primaire rol is het katalyseren van de vorming van γ-glutamylcysteïne, een voorloper van GSH. Dit proces is essentieel voor cellulaire verdediging tegen oxidatieve stress, ontgifting en het handhaven van intracellulaire redoxhomeostase. GCLC reguleert, in combinatie met GCLM, de snelheid van GSH-productie, waardoor het een cruciaal enzym is voor het handhaven van een goede cellulaire functie. De GCLC-activiteit wordt strak gereguleerd door de interactie met GCLM. GCLM verbetert de katalytische efficiëntie van GCLC, en de enzymactiviteit kan worden gemoduleerd als reactie op oxidatieve stress en veranderingen in metabole toestanden. Bovendien wordt de GCLC-expressie opgereguleerd tijdens oxidatieve stress om te voldoen aan de toegenomen vraag naar GSH. Het is ook betrokken bij ontgifting, modulatie van de immuunrespons en bescherming tegen reactieve zuurstofsoorten (ROS). Dysregulatie van GCLC-activiteit en GSH-productie wordt geassocieerd met neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, waarbij oxidatieve stress een prominent kenmerk is.

Gebruiksinformatie

Toepassing

WB, IP

Verdunning

WB	IP
1:20000	1:50

Reactiviteit

Human, Mouse, Rat

Bron

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

73 kDa

Opslagbuffer

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

Opslag
(Vanaf de datum van ontvangst)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

Experimentele Methoden
WB	Experimental Protocol: Sample preparation 1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature or lyse it by sonication on ice, then incubate on ice for 30 minutes. 2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and transfer the cells into an EP tube. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Add an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail), sonicate to lyse the cells, and incubate on ice for 30 minutes. 3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice.Add an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail), sonicate to lyse the cells, and incubate on ice for 30 minutes. 4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant; 5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration; 6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice. Electrophoretic separation 1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations 2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.) Transfer membrane 1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter; 2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer; 3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip"; 4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min. ( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.) Block 1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes; 2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature; 3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time. Antibody incubation 1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:20000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight; 2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time; 3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour; 4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time. Antibody staining 1300. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly; 2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system. (Exposure time of at least 90s is recommended)

Experimentele Methoden

WB

Experimental Protocol:

Sample preparation

1. Tissue: Lyse the tissue sample by adding an appropriate volume of ice-cold RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail)，and homogenize the tissue at a low temperature or lyse it by sonication on ice, then incubate on ice for 30 minutes.

2. Adherent cell: Aspirate the culture medium and transfer the cells into an EP tube. Wash the cells with ice-cold PBS twice. Add an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail), sonicate to lyse the cells, and incubate on ice for 30 minutes.

3. Suspension cell: Transfer the culture medium to a pre-cooled centrifuge tube. Centrifuge and aspirate the supernatant. Wash the cells with ice-cold PBS twice.Add an appropriate volume of RIPA/NP-40 Lysis Buffer (containing Protease Inhibitor Cocktail), sonicate to lyse the cells, and incubate on ice for 30 minutes.

4. Place the lysate into a pre-cooled microcentrifuge tube. Centrifuge at 4°C for 15 min. Collect the supernatant;

5. Remove a small volume of lysate to determine the protein concentration;

6. Combine the lysate with protein loading buffer. Boil 20 µL sample under 95-100°C for 5 min. Centrifuge for 5 min after cool down on ice.

Electrophoretic separation

1. According to the concentration of extracted protein, load appropriate amount of protein sample and marker onto SDS-PAGE gels for electrophoresis. Recommended separating gel (lower gel) concentration: 10%. Reference Table for Selecting SDS-PAGE Separation Gel Concentrations

2. Power up 80V for 30 minutes. Then the power supply is adjusted (110 V~150 V), the Marker is observed, and the electrophoresis can be stopped when the indicator band of the predyed protein Marker where the protein is located is properly separated. (Note that the current should not be too large when electrophoresis, too large current (more than 150 mA) will cause the temperature to rise, affecting the result of running glue. If high currents cannot be avoided, an ice bath can be used to cool the bath.)

Transfer membrane

1. Take out the converter, soak the clip and consumables in the pre-cooled converter;

2. Activate PVDF membrane with methanol for 1 min and rinse with transfer buffer;

3. Install it in the order of "black edge of clip - sponge - filter paper - filter paper - glue -PVDF membrane - filter paper - filter paper - sponge - white edge of clip";

4. The protein was electrotransferred to PVDF membrane. ( 0.45 µm PVDF membrane is recommended ) Reference Table for Selecting PVDF Membrane Pore Size Specifications

Recommended conditions for wet transfer: 200 mA, 120 min.

( Note that the transfer conditions can be adjusted according to the protein size. For high-molecular-weight proteins, a higher current and longer transfer time are recommended. However, ensure that the transfer tank remains at a low temperature to prevent gel melting.)

Block

1. After electrotransfer, wash the film with TBST at room temperature for 5 minutes;

2. Incubate the film in the blocking solution for 1 hour at room temperature;

3. Wash the film with TBST for 3 times, 5 minutes each time.

Antibody incubation

1. Use 5% skim milk powder to prepare the primary antibody working liquid (recommended dilution ratio for primary antibody 1:20000), gently shake and incubate with the film at 4°C overnight;

2. Wash the film with TBST 3 times, 5 minutes each time;

3. Add the secondary antibody to the blocking solution and incubate with the film gently at room temperature for 1 hour;

4. After incubation, wash the film with TBST 3 times for 5 minutes each time.

Antibody staining

1300. Add the prepared ECL luminescent substrate (or select other color developing substrate according to the second antibody) and mix evenly;

2. Incubate with the film for 1 minute, remove excess substrate (keep the film moist), wrap with plastic film, and expose in the imaging system. (Exposure time of at least 90s is recommended)

Referenties

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16081425/

Toepassingsgegevens

WB

Gevalideerd door Selleck

Lane 1: Jurkat
Lane 2: C6
Lane 3: NIH/3T3