Dyngo-4a (Hydroxy-Dynasore)

Dynamine I-activiteit wordt gemeten in zijn SAI-activiteitstoestand of gestimuleerd door drie verschillende methoden. Aangezien elke stimulus dynamine in verschillende mate activeert, vereist elke assay verschillende dynamineconcentraties. Ten eerste wordt maximale dynamine-activiteit gestimuleerd door gesoniceerde PS-liposomen. Gecultiveerde dynamine I (10–20 nM, verdund in: 6 mM Tris–HCl, 20 mM NaCl en 0,01% Tween 80, pH 7,4) wordt geïncubeerd in 96-well platen in GTPase-buffer (5 mM Tris–HCl, 10 mM NaCl, 2 mM Mg²⁺, 0,05% Tween 80, pH 7,4, 1 µg/mL leupeptine en 0,1 mM PMSF) en 0,3 mM GTP in aanwezigheid van het testcompound gedurende 30 min bij 37°C in een finaal assayvolume van 150 μL. Reacties worden beëindigd met 10 μL van 0,5 M ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) pH 7,4 en malachietgroenoplossing (40 μL: 2% w/v ammoniummolybdaattetrahydraat, 0,15% w/v malachietgroen en 4 M HCl) wordt gedurende 5 min toegevoegd. Ten tweede wordt dynamine (20 nM) gestimuleerd door 10 µg/mL taxol-gestabiliseerde, voorgevormde rundermicrotubuli met behulp van hetzelfde protocol. Ten derde wordt dynamine I (50 nM) gestimuleerd door 1 μM recombinant grb2, een SH3-bevattend eiwit dat dynamine ongeveer 5–10 keer minder efficiënt stimuleert dan liposomen of microtubuli. Ten slotte wordt dynamine (500 nM) SAI-activiteit gemeten met behulp van hoge dynamineconcentraties, die de coöperatieve zelfassemblage tot ringen (maar geen helices) bevorderen. De uiteindelijke DMSO-concentratie in de GTPase- of endocytose-assays is maximaal respectievelijk 3,3 of 1%, maar typisch 1%. De GTPase-assay voor dynamine I wordt niet beïnvloed door DMSO tot 3,3%. Verbindingen worden opgelost als 30 mM stocks in 100% DMSO. Deze stockoplossingen kunnen gedurende meerdere maanden bij –20°C worden bewaard. Verbindingen worden vervolgens verdund in oplossingen van 50% DMSO, bereid in 20 mM Tris–HCl pH 7,4 en opnieuw verdund in de uiteindelijke assay. Voor analyse van de kinetiek van deze verbindingremming wordt dynamine I in een uiteindelijke concentratie van 17 nM geïncubeerd met GTPase-buffer die PS (2 µg/mL) en variërende hoeveelheden GTP (50–250 μM) bevat in aanwezigheid van deze chemische stof in een concentratiebereik tussen 0,5 en 6 μM. De reactie wordt na 30 min gestopt door toevoeging van EDTA (0,5 mM, pH 7,4). Curves worden gegenereerd met behulp van de Michaelis–Menten-vergelijking v = Vmax[S]/(Km + [S]), waarbij S het GTP-substraat is. Nadat de Vmax- en Km-waarden waren bepaald, werden de gegevens getransformeerd met behulp van de Lineweaver–Burke-vergelijking, 1/v = 1/Vmax + (Km/Vmax)(1/[S]). Assaycondities zijn gebaseerd op de dynamine I-assay, maar bevatten aanpassingen. Recombinant dynamine II wordt gebruikt bij 50 nM, gestimuleerd door 10 µg/mL PS. De GTPase-reactie mag gedurende 90 min bij 37°C plaatsvinden voordat deze wordt beëindigd.

αT3–1 or LβT2 cells

30 μM

30 minutes

αT3-1 or LβT2 cells (2 × 10⁶) were grown overnight in a 6-well culture dish and then serum starved for 2–4 hours. Cells were pretreated with either vehicle (0), dynasore (80μM), or dyngo (30μM) for 30 minutes. For dose-response studies, indicated doses of this compound were used for a 30-minute pretreatment. After pretreatment, cells were treated with 0 or GnRHa (10 nM) for 10 minutes. Cells were then washed twice in PBS, lysed in radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer and subjected to SDS-PAGE (acrylamide:bis-acrylamide ratio of 29:1) and electroblotted to polyvinylidene difluoride membranes.

Female CD-1 mice

30 mg/kg

i.p.