Dovitinib (TKI258) Lactate monohydrate

Dovitinib remt krachtig de FGF-gestimuleerde groei van WT en F384L-FGFR3-expresserende B9-cellen met een IC50 van 25 nM. Bovendien remt Dovitinib de proliferatie van B9-cellen die elk van de verschillende geactiveerde mutanten van FGFR3 tot expressie brengen. Interessant is dat er minimale verschillen worden waargenomen in de gevoeligheid van de verschillende FGFR3-mutaties voor Dovitinib, waarbij de IC50 varieert van 70 tot 90 nM voor elk van de verschillende mutaties. IL-6-afhankelijke B9-cellen die alleen vector bevatten (B9-MINV-cellen) zijn resistent tegen de remmende activiteit van Dovitinib bij concentraties tot 1 μM. Dovitinib remt de celproliferatie van KMS11 (FGFR3-Y373C), OPM2 (FGFR3-K650E) en KMS18 (FGFR3-G384D) cellen met een IC50 van respectievelijk 90 nM (KMS11 en OPM2) en 550 nM. Dovitinib remt FGF-gemedieerde ERK1/2-fosforylatie en induceert cytotoxiciteit in FGFR3-expresserende primaire MM-cellen. BMSC's geven een bescheiden mate van resistentie met 44,6% groeiremming voor cellen behandeld met 500 nM Dovitinib en gekweekt op stroma, vergeleken met 71,6% groeiremming voor cellen gekweekt zonder BMSC's. Dovitinib remt de proliferatie van M-NFS-60, een M-CSF-groeigedreven muis-myeloblastische cellijn met een mediane effectieve concentratie (EC50) van 220 nM. [1] Behandeling van SK-HEP1-cellen met Dovitinib resulteert in een dosisafhankelijke vermindering van het aantal cellen en G2/M-fase-arrest met vermindering in de G0/G1- en S-fasen, remming van ankeronafhankelijke groei en blokkade van bFGF-geïnduceerde celmotiliteit. De IC50 voor Dovitinib in SK-HEP1-cellen is ongeveer 1,7 μM. Dovitinib vermindert ook significant de basale fosforylatatieniveaus van FGFR-1, FGFR-substraat 2α (FRS2-α) en ERK1/2, maar niet Akt, in zowel SK-HEP1- als 21-0208-cellen. In 21-0208 HCC-cellen remt Dovitinib significant de bFGF-geïnduceerde fosforylatie van FGFR-1, FRS2-α, ERK1/2, maar niet Akt. [2]

Dovitinib induceert zowel cytostatische als cytotoxische reacties in vivo, wat resulteert in regressie van FGFR3-expresserende tumoren.[1] Dovitinib vertoont een dosis- en blootstellingsafhankelijke remming van doelreceptor-tyrosinekinasen (RTK's) die tot expressie komen in tumorxenografts. Dovitinib remt krachtig de tumorgroei van zes HCC-lijnen. Remming van Angiogenesis correleerde met inactivatie van de FGFR/PDGFRβ/VEGFR2-signaleringsroutes. In een orthotoop model remt Dovitinib krachtig de primaire tumorgroei en longmetastase en verlengt het de overleving van muizen significant. [2] Toediening van Dovitinib resulteert in significante tumorgroeiremming en tumorregressies, inclusief grote, gevestigde tumoren (500-1.000 mm³). [3]

• In vitro kinase assays

  De waarden voor de inhiberende concentratie van 50% (IC50) voor de remming van RTK's door Dovitinib worden bepaald in een tijd-opgeloste fluorescentie (TRF) of radioactief formaat, waarbij de remming door Dovitinib van fosfaatoverdracht naar een substraat door het respectieve enzym wordt gemeten. De kinase domeinen van FGFR3, FGFR1, PDGFRβ en VEGFR1-3 worden getest in 50 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N^'-2-ethanesulfonzuur), pH 7.0, 2 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂, 1 mM NaF, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mg/mL bovien serum albumine (BSA), 0.25 μM gebiotinyleerd peptidesubstraat (GGGGQDGKDYIVLPI), en 1 tot 30 μM adenosine trifosfaat (ATP) afhankelijk van de K_m voor het respectieve enzym. ATP-concentraties liggen op of net onder de K_m. Voor c-KIT- en FLT3-reacties wordt de pH verhoogd tot 7.5 met 0.2 tot 8 μM ATP in aanwezigheid van 0.25 tot 1 μM gebiotinyleerd peptidesubstraat (GGLFDDPSYVNVQNL). Reacties worden bij kamertemperatuur geïncubeerd gedurende 1 tot 4 uur en het gefosforyleerde peptide wordt opgevangen op streptavidine-gecoate microtiterplaten die stopreactiebuffer bevatten (25 mM EDTA [ethyleendiaminetetraazijnzuur], 50 mM HEPES, pH 7.5). Gefosforyleerd peptide wordt gemeten met het DELFIA TRF-systeem met behulp van een Europium-gelabeld anti-fosfotyrosine antilichaam PT66. De Dovitinib-concentratie voor IC50 wordt berekend met behulp van niet-lineaire regressie met XL-Fit data-analyse software versie 4.1 (IDBS). Remming van de kinase-activiteit van de kolonie-stimulerende factor-1 receptor (CSF-1R), PDGFRα, insulinereceptor (InsR) en insuline-achtige groeifactor receptor 1 (IGFR1) wordt bepaald bij ATP-concentraties dicht bij de K_m voor ATP.

• Cellijnen

  B9 cells, MM cell lines

• Concentraties

  100 nM

• Incubatietijd

  48-96 hours

• Methode

  Cell viability is assessed by 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyl tetrazolium (MTT) dye absorbance. Cells are seeded in 96-well plates at a density of 5 × 10³ (B9 cells) or 2 × 10⁴ (MM cell lines) cells per well. Cells are incubated with 30 ng/mL aFGF and 100 μg/mL heparin or 1% IL-6 where indicated and increasing concentrations of Dovitinib. For each concentration of Dovitinib, 10 μL aliquots of drug or DMSO diluted in culture medium is added. For drug combination studies, cells are incubated with 0.5 μM dexamethasone, 100 nM Dovitinib, or both simultaneously where indicated. To evaluate the effect of Dovitinib on growth of MM cells adherent to BMSCs, 10⁴ KMS11 cells are cultured on BMSC-coated 96-well plates in the presence or absence of Dovitinib. Plates are incubated for 48 to 96 hours. For assessment of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)-mediated growth, 5 × 10³ M-NFS-60 cells/well are incubated with serial dilutions of Dovitinib with 10 ng/mL M-CSF and without granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). After 72 hours cell viability is determined using Cell Titer-Glo Assay. Each experimental condition is performed in triplicate.

• Dierlijke modellen

  8-week-old female BNX mice bearing KMS11 cells

• Doseringen

  10, 30, or 60 mg/kg

• Toediening

  p.o.