Dinaciclib (SCH 727965)

Dinaciclib is ook een potente DNA-replicatieremmer die de inbouw van thymidine (dThd) DNA in A2780-cellen blokkeert met een IC50 van 4 nM. Deze verbinding onderdrukt sterk de fosforylering van Rb op Ser 807/811 bij concentraties >6,25 nM, wat in overeenstemming is met de waarneming dat 4 nM-concentraties vereist zijn voor 50% remming van dThd DNA-inbouw in hetzelfde celmodel. Belangrijk is dat de volledige onderdrukking van Rb-fosforylering correleert met het begin van apoptose, zoals aangegeven door het verschijnen van het p85 PARP-splitsingsproduct in cellen die zijn blootgesteld aan >6,25 nM van deze chemische stof. Het is actief tegen een breed spectrum van menselijke tumorcellijnen. [1] Toevoeging van deze verbinding tijdens blootstelling onderdrukt ook de accumulatie van γ-H2AX, op een dosisafhankelijke manier. [2] Het remt de proliferatie van melanoomcellen en drijft melanoomcellen tot massale apoptose. [3] Deze chemische stof induceert de apoptose van verschillende osteosarcoomcellijnen, inclusief die resistent zijn tegen doxorubicine. Het verzwakt de fosforylering van RNAP II op serine 2 en de fosforylering van de CDK-remmer p27^Kip1 op threonine 187. Verminderingen in fosforyleringsactiviteit treden op bij 12 - 40 nM van deze verbinding (4 tot 16 uur na toevoeging). Het vermindert ook de fosforylering van Rb op serine 807/811. Deze chemische stof induceert de apoptose van mock- en p53-depleted U2OS-cellen in vergelijkbare mate. [4]

Dinaciclib i.p. toediening van 8, 16, 32 en 48 mg/kg dagelijks gedurende 10 dagen resulteert in tumorinhibitie van respectievelijk 70%, 70%, 89% en 96%. De MED (minimale effectieve dosis) van deze verbinding lijkt <8 mg/kg te zijn. Het wordt goed verdragen, en het maximale gewichtsverlies in de hoogste doseringsgroep is 5%. Deze chemische stof heeft dosisafhankelijke antitumoractiviteit in vivo, en bijna volledige remming van tumorgroei treedt op bij een dosisniveau onder de MTD (maximaal getolereerde dosis). Het heeft een korte plasmahalfwaardetijd bij muizen. [1]

• Cyclin/CDK kinase assay

  Recombinante cyclin/CDK holo-enzymen worden gezuiverd uit Sf9-cellen die zijn gemanipuleerd om baculovirussen te produceren die een specifieke cyclin of CDK tot expressie brengen. Cyclin/CDK-complexen worden typisch verdund tot een eindconcentratie van 50 μg/mL in een kinase reactiebuffer die 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT en 0.1 mM natriumorthovanadaat bevat. Voor elke kinase reactie worden 1 μg enzym en 20 μL van een 2-μM substraatoplossing (een gebiotinyleerd peptide afgeleid van histone H1) gemengd en gecombineerd met 10 μL van deze verdunde verbinding. De reactie wordt gestart door de toevoeging van 50 μL 2 μM ATP en 0.1 μCi ³³P-ATP. Kinase reacties worden 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd en gestopt door de toevoeging van 0.1% Triton X-100, 1 mM ATP, 5 mM EDTA en 5 mg/mL streptavidine-gecoate SPA-parels. SPA-parels worden opgevangen met behulp van een 96-wells GF/B-filterplaat en een Filtermate universele oogster. De parels worden tweemaal gewassen met 2 M NaCl en tweemaal met 2 M NaCl dat 1% fosforzuur bevat. Het signaal wordt vervolgens gemeten met behulp van een TopCount 96-wells vloeistofscintillatieteller.

• Cellijnen

  A2780 cells

• Concentraties

  0 μM -5 μM

• Incubatietijd

  24 hours

• Methode

  A2780 cells are maintained in DMEM plus 10% fetal bovine serum and passaged twice weekly by detaching the monolayer with trypsin-EDTA. One hundred microliters of A2780 cells (5 × 10³ cells) are added per well to a 96-well Cytostar-T plate and incubated for 16 hours to 24 hours at 37 °C. Dinaciclib is serially diluted in complete media plus 2% ¹⁴C-labeled dThd. Media are removed from the Cytostar T plate; 200 μL of various this compound dilutions are added in quadruplicate; and the cells are incubated for 24 hours at 37 °C. Accumulated incorporation of radiolabel is assayed using scintillation proximity and measured on a TopCoun^TM.

• Dierlijke modellen

  Nude mice bearing A2780 tumors

• Doseringen

  8 mg/kg, 16 mg/kg, 32 mg/kg, and 48 mg/kg

• Toediening

  Administered via i.p.