CP-673451

CP 673451 is een selectieve remmer van PDGFRα/β met een IC50 van 10 nM/1 nM, vertoont >450-voudige selectiviteit ten opzichte van andere angiogene receptoren. In glioblastoomtumoren zorgt dit verbinding (33 mg/kg) voor >50% remming van de PDGFR-β-receptor gedurende 4 uur, wat overeenkomt met een EC50 van 120 ng/mL in plasma bij C_max. In een sponsangiogenesemodel remt deze remmer 70% van de PDGF-BB-gestimuleerde angiogenese bij een dosis van 3 mg/kg (q.d. ×5, p.o., overeenkomend met 5,5 ng/mL bij C_max).[1] Deze chemische stof vermindert de celproliferatiesnelheid via mechanismen die een verminderde fosforylering van GSK-3α en GSK-3β omvatten. In zowel RD- als RUCH2-culturen vermindert het de rhabdosfeer-vormende capaciteit en cel differentiatie, en veroorzaakt het verhoogde senescentie. [2]

CP 673451 (dagelijkse p.o. ?0 dagen dosering routinematig) remt tumorgroei (ED50 < 33 mg/kg) in een aantal humane tumorxenografts die s.c. zijn gekweekt in athymische muizen, waaronder H460 humane longcarcinoom, Colo205 en LS174T humane coloncarcinomen, en U87MG humane glioblastoma multiforme. [1] In RUCH2 xenograft-dragende muizen vermindert deze verbinding tumorgroei en stromale celinfiltratie. [2]

• Kinase remmingsassay

  Een glutathione S-transferase-getagde kinase domeinconstructie van het intracellulaire deel van de PDGFR-β (aminozuren 693-1401, toegangsnr. J03278) wordt tot expressie gebracht in Sf-9 cellen (baculovirus expressiesysteem). Enzymkinetiek wordt bepaald door het enzym te incuberen met toenemende concentraties ATP in fosforyleringsbuffer [50 mmol/L HEPES (pH 7,3), 125 mmol/L NaCl, 24 mmol/L MgCl₂ in Nunc Immuno MaxiSorp 96-well platen die eerder zijn gecoat met 100 μL van 100 μg/mL poly-Glu-Tyr (4:1 verhouding) verdund in PBS. Na 10 minuten worden de platen gewassen (PBS, 0,1% Tween 20), geïncubeerd met anti-fosfotyrosine-mierikswortelperoxidase-antilichaam, en verdund in PBS, 0,05% Tween 20, 3% BSA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De platen worden gewassen zoals hierboven en geïncubeerd met 3,3

• Cellijnen

  PAE

• Concentraties

  ~3000 nM

• Incubatietijd

  18 min

• Methode

  PAE cells stably expressing full-length PDGFR and VEGFR have been generated. For cell-based selectivity assays, PAE cells are transfected with fulllength human PDGFR-a, PDGFR-h, or VEGFR-2. Cells are seeded at 4×10⁵ cells/mL in 50 μL growth medium (Ham's F-12 media supplemented with 10% fetal bovine serum, 50,000 units each penicillin and streptomycin. After 6 to 8 hours, the growth medium is replaced with 50 μL serum-depleted medium (as above, but with 0.1% fetal bovine serum) and cells are incubated overnight. Immediately before compound addition, the medium was replaced with 95 μL serum-depleted medium. Compounds are diluted in 100% DMSO, added to the cells at a final DMSO concentration of 0.25% v/v, and incubated at 37°C for 10 minutes. Cells are stimulated with the appropriate ligand and incubated as above for an additional 8 minutes. The medium is removed and the cells washed once with PBS, then lysed with 50 μL HNTG buffer [20 mmol/L HEPES (pH 7.5), 150 mmol/L NaCl, 2% Triton X-100, 10% glycerol, 5 μmol/L EDTA, 2 mmol/L NaVO₄, and 1 EDTA-free complete protease inhibitor tablet per 25 mL] for 5 minutes at room temperature. Lysates are then diluted with 50 μL HG buffer [20 mmol/L HEPES (pH 7.5), 10% glycerol]. The diluted cell lysates are mixed thoroughly, 50 μL of supernatant are transferred to the ELISA capture plate, and incubated at room temperature for 2 hours with agitation. ELISA capture plates are prepared by coating 96-well ReactiBind goat-antirabbit plates with 100 μL/well of 5 μg/mL rabbit anti-human PDGFR-h, anti-PDGFR-a, or anti-VEGFR-2 antibody for 60 to 90 minutes. At the end of the 2-hour incubation the plates are washed (PBS, 0.1% Tween 20) before incubation with anti-phosphotyrosine-horseradish peroxidase antibody (diluted in PBS, 0.05% Tween 20) for 30 minutes at room temperature. The plates are washed again, then incubated with tetramethylbenzidine and evaluated as described above. IC50 values are calculated as percent inhibition of control.

• Dierlijke modellen

  Athymic female mice

• Doseringen

  3, 10, or 33 mg/kg

• Toediening

  Oral gavage