CHIR-124

CHIR-124 is een chinolone-gebaseerd klein molecuul dat structureel geen verwantschap heeft met andere bekende remmers van Chk1. Deze verbinding interageert synergetisch met topoisomerase-giften (bijv. Camptothecin of SN-38) in het veroorzaken van groeiremming in een verscheidenheid aan kankercellijnen, waaronder borstcarcinoom (MDA-MB-231 en MDA-MB-435) en coloncarcinoom (SW-620 en Colo205), die allemaal het gemuteerde p53-gen bevatten. Het heft de SN-38-geïnduceerde S- en G2-M Cell Cycle Checkpoints op en versterkt apoptose in MDA-MD-435 borstkankercellen. De opheffing van het G2-M Cell Cycle Checkpoint en de inductie van apoptose door deze chemische stof worden versterkt door het verlies van p53. [1] Deze verbinding richt zich ook potent op andere kinasen zoals PDGFR en Flt3 met IC50 van respectievelijk 6,6 nM en 5,8 nM. [2]

CHIR-124 versterkt de groeiremmende effecten door het G₂-M Cell Cycle Checkpoint op te heffen en tumorapoptose te verhogen in een orthotoop borstkanker-xenograftmodel.

• Chk1 Assay

  Voor de Chk1-assay wordt het kinase-domein tot expressie gebracht in Sf9-insectencellen, en een gebiotinyleerd cdc25c-peptide dat de consensus Chk1/Chk2-fosforylatieplaats (*) (biotine-[AHX]SGSGS*GLYRSPSMP-ENLNRPR[CONH2]) bevat, wordt gebruikt als substraat. Een verdunningsreeks van CHIR-124 wordt gemengd met een kinasereactiebuffer die een uiteindelijke concentratie bevat van 30 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 4 mM EDTA, 25 mM β-glycerofosfaat, 5 mM MnCl₂, 0,01% runderserumalbumine, 1,35 nM CHK1-kinasedomein, 0,5 μM peptidesubstraat en 1 AM ongelabeld ATP, plus 5 nM ³³Pγ-gelabeld ATP (specifieke activiteit = 2.000 Ci/mmol). Reacties en detectie van de fosfaatoverdracht worden uitgevoerd met een radioactieve methode. Reacties worden gedurende 1 tot 4 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd en het gefosforyleerde peptide wordt op streptavidine-gecoate microwellplaten, die stopreactiebuffer (25 mM EDTA [ethyleendiaminetetraazijnzuur], 50 mM HEPES, pH 7,5) bevatten, gevangen. Gefosforyleerd peptide wordt gemeten met het DELFIA TRF-systeem met behulp van een europium-gelabeld anti-fosfotyrosine antilichaam PT66. De concentratie van deze verbinding voor IC50 wordt berekend met behulp van niet-lineaire regressie met XL-Fit data-analysesoftware.

• Cellijnen

  MDA-MB-231, MDA-MB-435, SW-620, and COLO 205 cells

• Concentraties

  0-2350 nM, dependent on cell types

• Incubatietijd

  48 hours

• Methode

  MDA-MB-231, MDA-MB-435, SW-620, and COLO 205 cells in log-phase are plated into 96-well microplates. CHIR-124 is serially diluted in the presence of six different concentrations of Camptothecin or 0 nM camptothecin. Camptothecin is also serially diluted in the absence of this compound. This chemical is added to cells in 96-well dishes and incubated at 37 °C for 48 hours. Each treatment condition is done in triplicate. Cell proliferation is monitored by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5- (3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), inner salt assay. MTS inner salt is added to the microplates, which are incubated for another 3 hours, and absorbance at 490 nm is read on a plate reader. The concentrations of each drug in the combinations required to produce 50% inhibition are plotted to generate the isoboles. Isobologram analysis of drug interaction is based the equation of Loewe additivity (1= D _A /IC50, _A + D_B/IC50, _B), where IC50, _A and IC50, _B are the concentrations of drugs to result in 50% inhibition for each drug alone, and D_A and D_B are concentrations of each drug in the combination that yield 50% overall inhibition. A diagonal line indicating Loewe additivity is included in each graph. Data points that fall below the line indicate synergy, whereas those that fall above the line will indicate antagonism

• Dierlijke modellen

  MDA-MB-435 cells are implanted in the mammary fat pad of 8- to 10-week-old female immunodeficient mice.

• Doseringen

  10 mg/kg or 20 mg/kg

• Toediening

  CHIR-124 is given orally four times daily × 6 on days 2 to 7 in captisol.