CFSE

Bereiding van CFDA-SE werkoplossing
1.1 Bereiding van de stamoplossing
Los 1 mg CFDA-SE op in 0,1794 mL DMSO om 10 mM CFSE te verkrijgen.
Opmerking: Het wordt aanbevolen de stamoplossing bij -20 ℃ of -80 ℃ donker te bewaren en herhaalde vries-dooi cycli te vermijden.
1.2 Bereiding van deze chemische werkoplossing
Verdun de stamoplossing in serumvrij celkweekmedium of PBS om 5-10 μM van deze chemische werkoplossing te verkrijgen.
Opmerking: Pas de concentratie van deze chemische werkoplossing aan de werkelijke situatie aan.
Celkleuring
2.1 Voor suspensiecellen: Centrifugeer bij 1000 g bij 4℃ gedurende 3-5 minuten en gooi vervolgens het supernatant weg. Was tweemaal met PBS, telkens 5 minuten.
Voor adherente cellen: Gooi het celkweekmedium weg en voeg trypsine toe om cellen te dissociëren tot een enkelcel suspensie. Centrifugeer bij 1000 g bij 4℃ gedurende 3-5 minuten en gooi vervolgens het supernatant weg. Was tweemaal met PBS, telkens 5 minuten.
2.2 Voeg 1 mL van deze chemische werkoplossing toe en incubeer vervolgens 30 minuten bij kamertemperatuur.
2.3 Centrifugeer bij 400 g bij 4℃ gedurende 3-4 minuten en gooi vervolgens het supernatant weg.
2.4 Was tweemaal met PBS, telkens 5 minuten.
2.5 Resuspendeer cellen met serumvrij celkweekmedium of PBS en detecteer vervolgens met een fluorescentiemicroscoop of flowcytometer.

In vivo labeling van cellen met CFSE is uitvoerbaar met vrijwel geen toxisch effect op de gelabelde of aangrenzende cellen. Het heeft voordelen bij relatief langdurige migratiestudies, zoals aangetoond door het herstel van T-cellen in de perifere lymfoïde organen[2].

• Cellijnen

  human erythroleukaemic cell line K562, mouse lymphoma cell line YAC-1, human mammary cancer cell line MCF-7 and human melanoma cell line A375

• Concentraties

  2 µM, 3 µM, 4 µM, 5 µM, 10 µM and 20 µM

• Incubatietijd

  5, 6, 7, 8, 10 and 15 min

• Methode

  The 5 mM CFDA-SE stock in DMSO is diluted to different concentrations(2 µM, 3 µM, 4 µM, 5 µM, 10 µM and 20 µM) in PBS with a total volume of 1 ml. After each cell line is harvested and washed three times with PBS, 1×10⁹ cells are added to equal volume of this compound with different concentrations and incubated at 37°C for 5, 6, 7, 8, 10 and 15 min with agitation. The labeling reaction is stopped for 1 min by adding an equal volume of heat inactivated fetal bovine serum. The CFDA-SE labeled cells are washed twice with PBS and recounted, and the cell concentration is adjusted to 6×104cells/ml in IMDM containing 10% FCS.

• Dierlijke modellen

  C57Bl/6 mice

• Doseringen

  10 μM

• Toediening

  injected into thymic lobe