PR-171 (Carfilzomib)

Carfilzomib (PR-171) remt de proliferatie in een verscheidenheid aan cellijnen en van patiënten afgeleide neoplastische cellen, waaronder multipel myeloom, en induceerde intrinsieke en extrinsieke apoptotische signaalroutes en activering van c-Jun-N-terminale kinase (JNK). Het onthult verbeterde anti-MM-activiteit, overwint resistentie tegen andere middelen en werkt synergetisch met (Dex). Deze verbinding toont een preferentiële in vitro remmende potentie tegen de ChT-L-activiteit in de β5-subeenheid, met meer dan 80% remming bij doses van 10 nM. Korte blootstelling aan een lage dosis Carfilzomib leidt tot preferentiële bindingsspecificiteit voor het β5 constitutieve 20S Proteasome en de β5i immunoproteasoom-subeenheden. Meting van caspase-activiteit in ANBL-6-cellen die ermee werden gepulseerd, toont substantiële toenames in caspase-8, caspase-9 en caspase-3-activiteit na 8 uur, wat een respectievelijk 3,2-, 3,9- en 6,9-voudige toename oplevert ten opzichte van controlecellen na 8 uur. In Carfilzomib-pulsbehandelde cellen is de mitochondriale membraanintegriteit gedaald tot 41% (Q1 + Q2), vergeleken met 75% in vehikelbehandelde controlecellen. [1] In een andere studie heeft het ook preklinische effectiviteit aangetoond tegen hematologische en solide maligniteiten. [2] Het remt direct de osteoclastvorming en botresorptie. [3]

Carfilzomib (PR-171) vermindert de tumorgroei matig in een in vivo xenograftmodel. Het vermindert effectief de levensvatbaarheid van multipel myeloomcellen na voortdurende of voorbijgaande behandeling. Deze verbinding verhoogt ook het trabeculaire botvolume, vermindert botresorptie en verbetert botvorming bij niet-tumor dragende muizen. [3]

• Enzyme-linked immunosorbent assay voor subunitprofilering van carfilzomib

  ANBL-6-cellen (2 × 10⁶/putje) worden geplateerd in 96-putjesplaten en gedurende 1 uur behandeld met Carfilzomib (PR-171) in doses van 0,001 tot 10 μM. Cellen worden vervolgens gelyseerd (20 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA) en geklaarde lysaten worden overgebracht naar polymeraseketenreactie (PCR)-platen. Een standaardcurve wordt gegenereerd met behulp van onbehandelde ANBL-6-cellysaten, beginnend bij een concentratie van 6 μg eiwit/μL. De actieve site probe [biotine-(CH2)4-Leu-Leu-Leu-epoxyketon; 20 μM] wordt toegevoegd en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Cellysaten worden vervolgens gedenatureerd door 1% natriumdodecylsulfaat (SDS) toe te voegen en te verwarmen tot 100°C, gevolgd door mengen met 20 μL per putje streptavidine-sepharose high-performance parels in een 96-putjes multiscreen DV-plaat en gedurende 1 uur geïncubeerd. Deze parels worden vervolgens gewassen met enzym-linked immunosorbent assay (ELISA)-buffer (PBS, 1% runderserumalbumine en 0,1% Tween-20), en 's nachts bij 4°C op een platenmenger geïncubeerd met antilichamen tegen Proteasome-subeenheden. Gebruikte antilichamen omvatten muismonoclonale anti-β1, anti-β2, anti-β1i en anti-β5i, geitenpolyclonale anti-β2i en konijnpolyclonale anti-β5 (affiniteitsgezuiverd antiserum tegen KLH-CWIRVSSDNVADLHDKYS-peptide). De parels worden gewassen en gedurende 2 uur geïncubeerd met mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire geiten-antikonijn-, geiten-antimuizen- of konijnen-antigeitenantilichamen. Na het wassen worden de parels ontwikkeld met behulp van het supersignal ELISA picochemiluminescentiesubstraat. Luminescente detectie wordt uitgevoerd. Ruwe luminescentie wordt omgezet naar μg/mL door vergelijking met de standaardcurve en uitgedrukt als % remming ten opzichte van de vehikelcontrole. Curvefits worden gegenereerd met behulp van de volgende niet-sigmoïdale dosis-responsvergelijking: Y = Bottom + (Top-Bottom)/(1 + 10̂((LogEC50 − X) × HillSlope)), waarbij X de logaritme van de concentratie is, Y de % remming en EC50 de dosis van deze verbinding die 50% effect toont.

• Cellijnen

  WST-1, ANBL-6 cells

• Concentraties

  100 nM

• Incubatietijd

  1 hour

• Methode

  WST-1 is used to determine the effects of Carfilzomib (PR-171), a proteasome inhibitor, on cell proliferation. The inhibition of proliferation is calculated in relation to parallel control cells that receives vehicle alone. A linear spline function is used to interpolate the median inhibitory concentration (IC50) using XLfit 4 software. The degree of resistance (DOR) is calculated using the formula: DOR = IC50(resistant cells)/IC50(sensitive cells). ANBL-6 cells pulsed with 100 nM of this compound are washed and suspended in PBS containing 5 μg/mL of JC-1, which exhibits potential-dependent accumulation in mitochondria. Analysis of the mitochondrial membrane potential-dependent color shift from 525 to 590 nm is carried out on a FacScan, and the data are analyzed with CellQuest software.

• Dierlijke modellen

  Beige-nude-XID mice

• Doseringen

  2.0 mg/kg

• Toediening

  i.v.