BRD4770

Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoro-ImmunoAssays (DELFIA) worden uitgevoerd in witte, ondoorzichtige 384-wells platen gecoat met Neutravidin. Testverbindingen worden verdund tot 12 μg/mL in 50 mM Tris-HCl pH 8,5 met 4% DMSO en 10 μL wordt in de putjes gedispenseerd. Blanco en controleputjes ontvingen alleen compoundbuffer. GST-G9a bij 10 μg/mL en SAM bij 40 μM worden verdund in 50 mM Tris HCl pH 8,5/10 mM DTT en toegevoegd in een volume van 20 μL. Blanco putjes ontvangen alleen Tris/DTT-buffer. De reacties worden geïnitieerd door de toevoeging van 800 nM H3(1-20)-cysbiotine substraat in 50 mM Tris pH 8,5 in een volume van 10 μL, en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten. De platen worden 3 keer gewassen met 100 μL wasbuffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 0,2% BSA). Vervolgens wordt 50 μL Fluoroimmunoassay (FI) Buffer (50 mM Tris HCl pH 7,8, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 40, 25 μM DTPA, 0,2% BSA, 0,05% BGG) met 5ng α-2X-di-meth H3-K9 en 5ng geiten anti-konijn Eu-chelaat toegevoegd aan alle putjes van de plaat, en de plaat wordt nog een uur geïncubeerd bij kamertemperatuur. De platen worden 3 keer gewassen met 100 μL wasbuffer, en 50 μL versterkingsoplossing wordt aan elk putje toegevoegd. Tijdsopgeloste fluorescentie wordt na 45 minuten gemeten op een Viewlux Microplate Imager, waarbij gedurende 15 seconden wordt afgebeeld met een 354 μs venster, 400 μs vertraging, excitatie bij 360 nm en emissie bij 618 nm.

PANC-1 cells

~20 μM

72 hours

PANC-1 cells are seeded and treated with BRD4770 in 6-well plates for 72 h. Cells are trypsinized and tested for soft agar colony formation using CytoSelect 96-Well Cell Transformation Assay, using the CyQuant GR dye to measure total cellular nucleic acid levels. Fluorescence is detected with an Analyst HT plate reader using a 485/520 nm filter set.