BI 2536

BI 2536 blokkeert de activiteiten van Plk2 en Plk3 in een iets mindere mate met respectievelijk IC50 van 3,5 nM en 9,0 nM. In HeLa-cellen leidt deze verbindingbehandeling, variërend van 10-100 nM, tot het blokkeren van de rekrutering van γ-tubuline en fosforylering van Apc6 bij mitotische centrozomen, remming van cohesine-afgifte van chromosoomarmen, inductie van monopolare spoelen, evenals een reeks andere mitotische processen waarvan bekend is dat ze afhankelijk zijn van Plk1. Deze chemische behandeling leidt tot het arresteren van HeLa-cellen in G2/M, vervolgens een sub-G1 DNA-piek die wijst op DNA-afbraak en apoptose, en geaccumuleerde gekliefde PARP p85-fragmenten op een concentratieafhankelijke manier. Het remt de groei van een panel van 32 menselijke kankercellijnen met EC50 van 2-25 nM, terwijl het de proliferatie van exponentieel groeiende hTERT-RPE1, humane navelstrengendotheelcellen (HUVEC's) en normale rattennier (NRK) cellen blokkeert met EC50 van 12-31 nM. [1] Plk1-remming door deze verbinding vermindert de groei en levensvatbaarheid van anaplastische schildkliercarcinoom (ATC)-cellen zoals CAL62, OCUT-1, SW1736, 8505C en ACT-1 met EC50-waarden van 1,4-5,6 nM. [2]

BI 2536, een- of tweemaal per week i.v. toegediend, is zeer effectief in diverse xenograftmodellen met een aanvaardbare verdraagbaarheid door celproliferatie te remmen via een mitotische arrestatie, en vervolgens tumorceldood te induceren. Toediening van deze verbinding met 50 mg/kg een- of tweemaal per week remt de groei van HCT 116 xenografts significant met een T/C van respectievelijk 15% en 0,3%. Deze tweewekelijkse chemische behandeling leidt ook tot uitstekende tumorgroei in BxPC-3 en A549 modellen met een T/C van respectievelijk 5% en 14%. [1]

• Plk1 in vitro kinase assay

  Recombinant humaan Plk1 (residuen 1-603) wordt uitgedrukt als een N-terminaal, GST-gelabeld fusie-eiwit met een baculoviraal expressiesysteem en gezuiverd door affiniteitschromatografie met glutathion-agarose. Enzymactiviteitsassays voor Plk1 worden uitgevoerd in aanwezigheid van serieel verdund BI 2536 met 20 ng recombinant kinase en 10 μg caseïne van koeienmelk als substraat. Kinase-reacties worden uitgevoerd in een eindvolume van 60 μL gedurende 45 minuten bij 30 °C (15 mM MgCl₂, 25 mM MOPS [pH 7,0], 1 mM DTT, 1% DMSO, 7,5 mM ATP, 0,3 μCi γ-³³P-ATP). Reacties worden beëindigd door de toevoeging van 125 μL ijskoude 5% TCA. Na overdracht van de precipitaten naar Multi-Screen gemengde ester cellulose filterplaten, worden de platen gewassen met 1% TCA en radiometrisch gekwantificeerd. De dosis-respons curve wordt gebruikt voor het berekenen van de IC50-waarde.

• Cellijnen

  HeLa, A43, SKOV-3, HT-29, K562, A549, Saos-2, MCF7, HCT116, COLO 205, Hep G2, Raji and PC-3 cells, etc.

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~1 μM

• Incubatietijd

  24 and 72 hours

• Methode

  Cells are exposed to various concentrations of BI 2536 for 24, and 72 hours. Cell growth is assessed by the measurement of Alamar Blue dye conversion in a fluorescence spectrophotometer. For determining the DNA content of the cultures, cell suspensions are fixed in 80% ethanol, treated for 5 minutes with 0.25% Triton X-100 in PBS, and incubated with 0.1% RNase and 10 μg/mL propidium iodide (PI) in PBS for 20 minutes at RT. Cell-cycle profiles are determined by flow cytometric analysis.

• Dierlijke modellen

  Female BomTac:NMRI-Foxn1^nu mice injected subcutaneously with HCT 116, NCI-H460, or A549 cells

• Doseringen

  ~50 mg/kg

• Toediening

  Injection i.v. once or twice per week