Tivantinib

Van ARQ-197 is aangetoond dat het HGF/c-Met-geïnduceerde cellulaire reacties in vitro voorkomt. Deze verbinding bezit antitumorale activiteit; het remt de proliferatie van A549-, DBTRG- en NCI-H441-cellen met een IC50 van 0,38, 0,45, 0,29 μM. Behandeling met dit middel resulteert in een afname van de fosforylering van de MAPK-signaalcascade en preventie van invasie en migratie. Bovendien zorgt ectopische expressie van c-Met in NCI-H661, een cellijn zonder endogene expressie van c-Met, ervoor dat het een invasief fenotype verwerft dat ook wordt onderdrukt door dit chemische middel. Hoewel de toevoeging van toenemende concentraties van deze remmer de K_m van ATP niet significant beïnvloedt, verminderde blootstelling van c-Met aan 0,5 μM van deze substantie de V_max van c-Met met ongeveer 3-voudig. Het vermogen van dit molecuul om de V_max te verlagen zonder de Km van ATP te beïnvloeden, bevestigde dat het c-Met remt via een niet-ATP-competitief mechanisme en kan daarom de hoge mate van kinase-selectiviteit verklaren. Het verhindert humaan recombinant c-Met met een berekende remmingsconstante K_i van ongeveer 355 nM. Hoewel de hoogst gebruikte ATP-concentratie 200 μM is, wordt de potentie van dit compound tegen c-Met niet verminderd door ATP-concentraties tot 1 mM te gebruiken. Het blokkeert c-Met-fosforylering en stroomafwaartse c-Met-signaalroutes. Dit chemische middel onderdrukt constitutieve en ligand-gemedieerde c-Met-autofosforylering en, bij uitbreiding, c-Met-activiteit, wat op zijn beurt leidt tot de remming van stroomafwaartse c-Met-effectoren. De inductie van caspase-afhankelijke apoptose wordt verhoogd in c-Met-expresserende menselijke kankercellen, waaronder HT29-, MKN-45- en MDA-MB-231-cellen.[1][2]

Alle drie de met Tivantinib behandelde xenograftmodellen vertonen een vermindering van de tumorgroei: 66% in het HT29-model, 45% in het MKN-45-model en 79% in het MDA-MB-231-model. In deze xenograftstudies werden geen significante veranderingen in het lichaamsgewicht waargenomen na orale toediening van deze verbinding bij 200 mg/kg. Farmacodynamisch wordt de fosforylering van c-Met in humane colon-xenografttumoren (HT29) sterk geremd door dit chemische middel, zoals beoordeeld door een dramatische vermindering van c-Met-autofosforylering 24 uur na een enkele orale dosis van 200 mg/kg van dit middel. Dezelfde dosering bij muizen toont aan dat tumorxenografts worden blootgesteld aan aanhoudende plasmaconcentraties van de verbinding, consistent met de waargenomen farmacodynamische remming van c-Met-fosforylering en remming van de proliferatie van c-Met-bevattende kankercellijnen. Plasmaconcentraties van het middel 10 uur na dosering bleken 1,3 μM te zijn, meer dan 3 keer boven de biochemische remmingsconstante van deze stof voor c-Met. Daarom is het in staat om zijn doelwit in vivo in het xenografted menselijke tumorweefsel te onderdrukken. Concluderend blokkeert deze remmer de groei van c-Met-afhankelijke xenografted menselijke tumoren.[1]

• c-Met SDS-PAGE in vitro kinase-assay

  Recombinant c-Met-eiwit (100 ng) wordt gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voor-geïncubeerd met toenemende concentraties van deze verbinding. Na pre-incubatie worden 100 μM poly-Glu-Tyr-substraat en verschillende concentraties ATP met 5 μCi [γ-32P]ATP aan het reactiemengsel toegevoegd. De reactie wordt 5 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd en vervolgens gestopt door de toevoeging van 5 μL SDS-polyacrylamidegel, reducerende monsterbuffer. De monsters worden vervolgens op een 7,5% acrylamidegel geladen en SDS-PAGE wordt uitgevoerd. De gefosforyleerde poly-Glu-Tyr-substraten worden uiteindelijk gevisualiseerd door autoradiografie. De c-Met-activiteit wordt gekwantificeerd door densitometrie.

• Cellijnen

  T29, MKN-45 and MDA-MB-231 cells

• Concentraties

  0.03-10 μM

• Incubatietijd

  24, 32, and 48 hours

• Methode

  HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are seeded in black 96-well plates at 5 × 10³ cells per well overnight in a medium with 10% FBS. The next day, cells are treated with increasing concentrations of this compound (0.03-10 μM) for 24, 32, and 48 hours at 37 °C. After this compound treatment, the drug-containing medium is removed and cells are incubated for at least 10 minutes in a labeling solution (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, and 6 mM CaCl₂) containing 2 μg/mL Hoescht 33342 (blue channel), 500-times diluted Annexin V-FITC (green channel), and 1 μg/mL propidium iodide (red channel). High-content image acquisition and analysis are carried out. The program is set to take four images per well. The exposure time is set at 16.7 ms/10% gain, 500 ms/35% gain, and 300 ms/30% gain for the 4,6-diamidino-2-phenylindole, FITC, and rhodamine channels, respectively. Images are processed and the numbers of positive cells for each channel and each condition are determined. In addition, HT29 cells are treated with increasing concentrations of this compound for 32 hours in the absence or the presence of 25, 50, and 100 μM ZvAD-FMK (irreversible general caspase inhibitor), and the same procedures are undertaken. All experiments are done in triplicate. To determine whether the apoptotic effect is due to c-Met inhibition, the effect of this compound when glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and c-Met are knocked down using siRNA is investigated. HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are transfected with a nontargeted control siRNA, a gapgh-targeted control siRNA, or a met-targeted siRNA. After 3 days, c-Met, GAPDH, and β-actin expression levels are determined using specific antibodies. To determine if the effect is caspase dependent, HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are transfected with a met-targeted siRNA for 2 days and incubated in the absence or the presence of increasing concentrations of ZvAD-FMK for 1 additional day. A nontargeted siRNA and a gapgh-targeted siRNA (siRNA GAPDH) are also transfected in parallel, as controls. Cells are then stained with Annexin V-FITC and propidium iodide, and the percentage of apoptotic cells is determined.

• Dierlijke modellen

  Female athymic nude mice bearing HT29, MKN-45, or MDA-MB-231 tumor xenografts

• Doseringen

  200 mg/kg

• Toediening

  Orally administered