Sorafenib Tosylate (BAY 43-9006)

Sorafenib tosylate remt zowel wild-type als V599E mutant B-Raf activiteit met een IC50 van respectievelijk 22 nM en 38 nM. Deze verbinding remt ook potent mVEGFR2 (Flk-1), mVEGFR3, mPDGFRβ, Flt3 en c-Kit met een IC50 van respectievelijk 15 nM, 20 nM, 57 nM, 58 nM en 68 nM. Het remt FGFR-1 zwak met een IC50 van 580 nM. Deze chemische stof is niet actief tegen ERK-1, MEK-1, EGFR, HER-2, IGFR-1, c-Met, PKB, PKA, cdk1/cyclinB, PKCα, PKCγ en pim-1. Het remt de VEGFR2-fosforylatie in NIH 3T3-cellen significant met een IC50 van 30 nM, en de Flt-3-fosforylatie in HEK-293-cellen met een IC50 van 20 nM. Het blokkeert potent MEK 1/2 en ERK 1/2 fosforylatie in de meeste cellijnen, maar niet in A549 of H460 cellen, terwijl het geen effect heeft op de remming van de PKB-route. Het remt de proliferatie van HAoSMC- en MDA-MB-231-cellen met een IC50 van respectievelijk 0,28 μM en 2,6 μM. [1] Naast de remming van de RAF/MEK/ERK signaalroute, remt het significant de fosforylatie van eIF4E en reguleert het de Mcl-1-niveaus in hepatocellulaire carcinoom (HCC) cellen op een MEK/ERK-onafhankelijke manier. Het remt de proliferatie van PLC/PRF/5- en HepG2-cellen met een IC50 van respectievelijk 6,3 μM en 4,5 μM, en leidt tot de significante inductie van apoptose. [2]

Orale toediening van Sorafenib tosylate (~60 mg/kg) toont een breed spectrum, dosisafhankelijke anti-tumor activiteit tegen een verscheidenheid aan menselijke tumorxenograftmodellen, waaronder MDA-MB-231, Colo-205, HT-29, DLD-1, NCI-H460 en A549, zonder bewijs van toxiciteit. In combinatie met de anti-tumor werkzaamheid remt de behandeling met dit compound potent MEK 1/2 fosforylatie en pERK 1/2 niveaus in HT-29 en MDA-MB-231 xenografts, maar niet in Colo-205 xenografts, en onderdrukt het significant het tumor microvaatgebied (MVA) en de microvaatdichtheid (MVD) in MDA MB-231, HT-29 en Colo-205 tumorxenografts. [1] De behandeling met dit compound produceert dosisafhankelijke groeiremming van PLC/PRF/5 tumorxenografts in SCID-muizen met TGI's van respectievelijk 49% en 78% bij 10 mg/kg en 30 mg/kg, consistent met de remming van ERK- en eIF4E-fosforylatie, reductie van het microvaatgebied en inductie van tumorcelapoptose. [2]

• Biochemische assays

  Recombinante baculovirussen die Raf-1 (residu's 305–648) en B-Raf (residu's 409–765) tot expressie brengen, worden gezuiverd als fusie-eiwitten. Volledige lengte humane MEK-1 wordt gegenereerd door PCR en gezuiverd als een fusie-eiwit uit Escherichia coli-lysaten. Sorafenib tosylate wordt toegevoegd aan een mengsel van Raf-1 (80 ng), of B-Raf (80 ng) met MEK-1 (1 μg) in assaybuffer [20 mM Tris (pH 8.2), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, en 0.15% β-mercapto-ethanol] bij een eindconcentratie van 1% DMSO. De Raf kinase assay (eindvolume van 50 μL) wordt gestart door 25 μL van 10 μM γ[³³P]ATP (400 Ci/mol) toe te voegen en geïncubeerd bij 32 °C gedurende 25 minuten. Gefosforyleerd MEK-1 wordt geoogst door filtratie op een fosfocellulosemat, en 1% fosforzuur wordt gebruikt om ongebonden radioactiviteit weg te spoelen. Na drogen door microgolfverwarming wordt een β-plaatcounter gebruikt om filtergebonden radioactiviteit te kwantificeren. Humaan VEGFR2 (KDR) kinase domein wordt tot expressie gebracht en gezuiverd uit Sf9-lysaten. Tijdopgeloste fluorescentie-energietransfer assays voor VEGFR2 worden uitgevoerd in 96-well ondoorzichtige platen in het tijdopgeloste fluorescentie-energietransfer formaat. De uiteindelijke reactiecondities zijn als volgt: 1 tot 10 μM ATP, 25 nM poly GT-biotine, 2 nM Europium-gelabeld fosfo (p)-Tyr antilichaam (PY20), 10 nM APC, 1 tot 7 nM cytoplasmatisch kinase domein in eindconcentraties van 1% DMSO, 50 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 0.1 mM EDTA, 0.015% Brij-35, 0.1 mg/mL BSA, en 0.1% β-mercapto-ethanol. De reactievolumes zijn 100 μL en worden gestart door toevoeging van enzym. Platen worden afgelezen op zowel 615 als 665 nM op een Perkin-Elmer VictorV Multilabel counter na ~1.5 tot 2.0 uur na reactie-initiatie. Signaal wordt berekend als een verhouding: (665 nm/615 nM) × 10.000 voor elke well. Voor IC50-generatie wordt deze verbinding toegevoegd vóór de enzyminitiatie. Een 50-voudige stockplaat wordt gemaakt met deze chemische stof, serieel 1:3 verdund in een 50% DMSO/50% gedestilleerd water oplossing. De uiteindelijke concentraties van deze verbinding variëren van 10 μM tot 4.56 nM in 1% DMSO.

• Cellijnen

  MDA-MB-231, and HAoSMC

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Incubatietijd

  72 hours

• Methode

  Cells are exposed to increasing concentrations of Sorafenib tosylate for 72 hours. Cell number is quantitated using the Cell TiterGlo ATP Luminescent assay kit. This assay measures the number of viable cells per well by measurement of luminescent signal based on amount of cellular ATP.

• Dierlijke modellen

  Female NCr-nu/nu mice implanted s.c. with MDA-MB-231, Colo-205, HT-29, H460, or A549 cells

• Doseringen

  ~60 mg/kg

• Toediening

  Orally once daily