PF-02341066 (Crizotinib)

PF-2341066 vertoont vergelijkbare potentie tegen c-Met-fosforylering in mIMCD3 muizen- of MDCK hondenepitheelcellen met IC50 van respectievelijk 5 nM en 20 nM. Deze verbinding vertoont verbeterde of vergelijkbare activiteit tegen NIH3T3-cellen die zijn gemanipuleerd om c-Met ATP-bindingsplaatsmutanten V1092I of H1094R of de P-loop-mutant M1250T tot expressie te brengen met IC50 van respectievelijk 19 nM, 2 nM en 15 nM, vergeleken met NIH3T3-cellen die de wildtype-receptor tot expressie brengen met IC50 van 13 nM. Daarentegen wordt een duidelijke verschuiving in potentie van deze verbinding waargenomen tegen cellen die zijn gemanipuleerd om c-Met-activeringslusmutanten Y1230C en Y1235D tot expressie te brengen met IC50 van respectievelijk 127 nM en 92 nM, vergeleken met de wildtype-receptor. Het voorkomt ook krachtig de fosforylering van c-Met in NCI-H69- en HOP92-cellen, met IC50 van respectievelijk 13 nM en 16 nM, die de endogene c-Met-varianten R988C en T1010I tot expressie brengen. Deze verbinding is >1.000-voudig selectief voor de VEGFR2- en PDGFRβ RTK's, >250-voudig selectief voor IRK en Lck, en ∼40- tot 60-voudig selectief voor Tie2, TrkA en TrkB, dit alles vergeleken met c-Met. Het is 20- tot 30-voudig selectief voor RON- en Axl RTK's. Daarentegen vertoont deze verbinding een bijna equivalente IC50 van 24 nM tegen de nucleofosmine (NPM)-anaplastische lymfoomkinase (ALK) oncogene fusievariant van de ALK RTK die tot expressie wordt gebracht door de KARPAS299 menselijke anaplastische grootcellige lymfoom (ALCL) cellijn. Het remt c-Met-afhankelijke neoplastische fenotypes van kankercellen en angiogene fenotypes van endotheelcellen. Deze chemische stof onderdrukt de groei van menselijke GTL-16 maagcarcinoomcellen met een IC50 van 9,7 nM. Het induceert apoptose in GTL-16-cellen met een IC50 van 8,4 nM. Het remt HGF-gestimuleerde migratie en invasie van menselijke NCI-H441 longcarcinoomcellen met IC50 van respectievelijk 11 nM en 6,1 nM. Het remt MDCK-celverstrooiing met een IC50 van 16 nM. Het voorkomt HGF-gestimuleerde c-Met-fosforylering, celoverleving en Matrigel-invasie met IC50 van respectievelijk 11 nM, 14 nM en 35 nM. Bovendien voorkomt het serum-gestimuleerde HMVEC-vertakkende tubulogenese (vorming van vasculaire buizen) in fibrinegels. [1] Het remt ook krachtig NPM-ALK-fosforylering in Karpas299- of SU-DHL-1 ALCL-cellen met een IC50 van 24 nM. Deze verbinding voorkomt krachtig celproliferatie, wat gepaard gaat met G(1)-S-fase celcyclusarrest en inductie van apoptose in ALK-positieve ALCL-cellen met IC50 van 30 nM, maar niet in ALK-negatieve lymfoomcellen. [2] Bovendien voorkomt het osteosarcoomgedrag geassocieerd met primaire tumorgroei (d.w.z. proliferatie en overleving) en metastase (bijv. invasie en clonogeniteit). [3]

In het GTL-16-model toont PF-2341066 het vermogen om een duidelijke regressie van grote gevestigde tumoren (>600 mm³) te veroorzaken in zowel de 50 mg/kg/dag als de 75 mg/kg/dag behandelingscohorten, met een afname van 60% in het gemiddelde tumorvolume gedurende het 43-daagse toedieningsschema. In een andere studie toont deze verbinding het vermogen om de GTL-16-tumorgroei gedurende >3 maanden volledig te remmen, waarbij slechts 1 van de 12 muizen een significante toename van de tumorgroei vertoonde gedurende het 3-maandse behandelingsschema van 50 mg/kg/dag. In het NCI-H441 NSCLC-model wordt een afname van 43% in het gemiddelde tumorvolume waargenomen bij 50 mg/kg/dag gedurende de 38-daagse PF-2341066-toedieningscyclus. In het Caki-1 RCC-model wordt een afname van 53% in het gemiddelde tumorvolume waargenomen, geassocieerd met een afname van het volume van elke tumor met ten minste 30% bij 50 mg/kg/dag gedurende de 33-daagse PF-2341066-toedieningscyclus. Deze verbinding toont ook een bijna volledige preventie van de groei van gevestigde tumoren bij 50 mg/kg/dag in de U87MG-glioblastoom- of PC-3-prostaatcarcinoom-xenograftmodellen, met respectievelijk 97% of 84% remming op de laatste studiedag. Daarentegen remt deze chemische stof, oraal toegediend bij 50 mg/kg/dag, de tumorgroei niet significant in het MDA-MB-231-borstcarcinoommodel of het DLD-1-coloncarcinoommodel. Een significante dosisafhankelijke reductie van CD31-positieve endotheelcellen wordt waargenomen bij 12,5 mg/kg/dag, 25 mg/kg/dag en 50 mg/kg/dag in GTL-16-tumoren, wat aangeeft dat remming van MVD een dosisafhankelijke correlatie vertoont met antitumorale werkzaamheid. Deze verbinding vertoont een significante dosisafhankelijke reductie van menselijke VEGFA- en IL-8-plasmaspiegels in zowel de GTL-16- als U87MG-modellen. Een duidelijke remming van gefosforyleerde c-Met-, Akt-, Erk-, PLCλ1- en STAT5-niveaus wordt waargenomen in GTL-16-tumoren na orale toediening van deze verbinding.[1] Orale toediening van deze chemische stof aan severe gecombineerde immunodeficiënte-beige muizen met Karpas299 ALCL-tumorxenografts leidt tot dosisafhankelijke antitumorale werkzaamheid met volledige regressie van alle tumoren bij de dosis van 100 mg/kg/dag binnen 15 dagen na de initiële toediening van de verbinding. Bovendien wordt de remming van belangrijke NPM-ALK-signaleringsmediatoren, waaronder fosfolipase C-gamma, signaaltransducers en activatoren van transcriptie 3, extracellulaire signaal-gereguleerde kinasen en Akt door deze verbinding waargenomen bij concentraties of dosisniveaus die correleerden met remming van NPM-ALK-fosforylering en -functie.[2] Deze verbinding voorkomt osteosarcoomgedrag geassocieerd met primaire tumorgroei (bijv. proliferatie en overleving) en metastase (bijv. invasie en clonogeniteit). Bij naakte muizen behandeld met deze chemische stof via orale sondevoeding, worden de groei en geassocieerde osteolyse en extracorticale botmatrixvorming van osteosarcoomxenografts voorkomen door deze verbinding.[3] Behandeling van c-MET-geamplificeerde GTL-16-xenografts met 50 mg/kg van deze verbinding veroorzaakt tumorregressie die geassocieerd is met een langzame vermindering van ¹⁸F-FDG-opname en een afname van de expressie van de glucosetransporter 1, GLUT-1.[4]

• Cellulaire kinasefosforylering ELISA-assays

  Cellen worden gezaaid in 96-well platen in media aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en na 24 uur overgebracht naar serumvrije media [met 0,04% bovine serumalbumine (BSA)]. In experimenten die ligand-afhankelijke RTK-fosforylering onderzoeken, worden overeenkomstige groeifactoren tot 20 minuten toegevoegd. Na incubatie van cellen met deze verbinding gedurende 1 uur en/of geschikte liganden gedurende de aangegeven tijden, worden de cellen eenmaal gewassen met HBSS aangevuld met 1 mM Na₃VO₄, en worden proteïnelysaten uit de cellen gegenereerd. Vervolgens wordt de fosforylering van geselecteerde proteïnekinasen beoordeeld door middel van een sandwich ELISA-methode met behulp van specifieke vangantistoffen die worden gebruikt om 96-well platen te coaten en een detectie-antistof die specifiek is voor gefosforyleerde tyrosineresiduen. Antistof-gecoate platen worden (a) 's nachts bij 4°C geïncubeerd in aanwezigheid van proteïnelysaten; (b) zeven keer gewassen in 1% Tween 20 in PBS; (c) 30 minuten geïncubeerd in een mierikswortelperoxidase-geconjugeerde anti-totaal-fosfotyrosine (PY-20) antistof (1:500); (d) opnieuw zeven keer gewassen; (e) geïncubeerd in 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine-peroxidase-substraat om een colorimetrische reactie te initiëren die wordt gestopt door toevoeging van 0,09 N H₂SO₄; en (f) gemeten op absorptie bij 450 nm met behulp van een spectrofotometer.

• Cellijnen

  GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells

• Concentraties

  0-256 nM

• Incubatietijd

  1 hour

• Methode

  Cells including GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells are seeded in 96-well plates in media supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and transferred to serum-free media [with 0.04% bovine serum albumin (BSA)] after 24 hours. In experiments investigating ligand-dependent RTK phosphorylation, corresponding growth factors are added for up to 20 minutes. After incubation of cells with this compound for 1 hour and/or appropriate ligands for the designated times, cells are washed once with HBSS supplemented with 1 mM Na₃VO₄, and protein lysates are generated from cells. Subsequently, phosphorylation of selected protein kinases is assessed by a sandwich ELISA method using specific capture antibodies used to coat 96-well plates and a detection antibody specific for phosphorylated tyrosine residues. Antibody-coated plates are (a) incubated in the presence of protein lysates at 4 °C overnight; (b) washed seven times in 1% Tween 20 in PBS; (c) incubated in a horseradish peroxidase–conjugated anti–total-phosphotyrosine (PY-20) antibody (1:500) for 30 min; (d) washed seven times again; (e) incubated in 3,3^′,5,5^′-tetramethyl benzidine peroxidase substrate to initiate a colorimetric reaction that is stopped by adding 0.09 N H₂SO₄; and (f) measured for absorbance in 450 nm using a spectrophotometer.

• Dierlijke modellen

  Female or male nu/nu mice bearing NCI-H441,or DLD-1, or MDA-MB-231

• Doseringen

  12.5 mg/kg/day, 25 mg/kg/day, and 50 mg/kg/day

• Toediening

  Administered via p.o.