OSI-027

OSI-027 vertoont selectieve en ATP-competitieve remmingsactiviteiten tegen mTORC1 en mTORC2 met respectievelijk een IC50 van 22 nM en 65 nM. Bovendien remt deze verbinding de mTOR-signalering van fosfo-4E-BP1 met een IC50 van 1 μM in celgebaseerde assays. [1] Het vertoont antiproliferatieve activiteiten tegen verschillende acute leukemie-cellijnen van myeloïde/megakaryocytaire oorsprong op een dosisafhankelijke manier, waaronder U937, KG-1, KBM-3B, ML-1, HL-60 en MEG-01 cellen. [2] Een recente studie toont aan dat remming van mTORC1/2 door deze chemische stof de fosforylering van Akt (S473) en celproliferatie in borstkankercellen effectief onderdrukt. [3]

In GEO colorectale xenograft remt OSI-027 (65 mg/kg) zowel mTORC1- als mTORC2-effectoren, inclusief 4E-BP1, Akt en S6 fosforylering. Bovendien remt de gecombineerde mTORC1- en mTORC2-remming door deze verbinding de tumorgroei krachtiger dan mTORC1-remming door rapamycine. [1]

• Biochemische assays

  mTORC1- en mTORC2-remming wordt bepaald met behulp van een natief enzymcomplex dat is geïmmunoprecipiteerd uit HeLa-lysaten bij 1 mM ATP. Om hele cellenlysat uit HeLa-cellen te bereiden, wordt 25 g celpellet gedurende 30 minuten in 60 ml ijskoude buffer A [40 mM HEPES (pH 7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM natriumpyrofosfaat, 10 mM glycerofosfaat, 50 mM NaF, 0,5 mM orthovanadaat en EDTA-vrije protease-remmers die 0,3% CHAPS bevatten] gelyseerd op een magnetische roerder in een koelcel. Nadat de lysaten zijn geklaard door centrifugatie bij 13.000 g gedurende 10 minuten, worden met Proteïne G gecoate 384-wells platen geïncubeerd met 0,25 μg mTOR-antilichaam in 15 μL buffer A gedurende 1 uur bij 4 °C. Aan elk putje wordt 40 μg HeLa-cellelysat in 15 μL buffer A toegevoegd en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C om mTOR-complexen te immunoprecipiteren. Platen worden 3 keer gewassen met buffer A en twee keer met immunoprecipitatie-wasbuffer [Buffer B: 50 mM HEPES (pH 7,5) en 150 mM NaCl]. OSI-027 wordt toegevoegd in een concentratie van 10 μM aan elk putje en DMSO wordt toegevoegd aan de controleputjes. De reactie wordt gestart door 150 ng His-gelabeld 4E-BP1 als substraat toe te voegen in aanwezigheid of afwezigheid van 100 μM ATP aan elk putje in 25 μL vers bereide kinasebuffer [Buffer C: 20 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 4 mM MnCl₂, 10 mM β-mercapto-ethanol en 200 μM vanadaat] en geïncubeerd bij kamertemperatuur (RT) gedurende 30 minuten. De reactie wordt gestopt door 25 μL reactiemengsel van elk putje over te brengen naar corresponderende putjes van verse met Ni-chelaat gecoate platen en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C gevolgd door 2 uur bij 37 °C. Om fosforylering van 4E-BP1 te detecteren, worden de platen één keer gewassen met TBST (Tris-gebufferde fysiologische zoutoplossing met 0,1% Tween-20) met 5% mageremelkpoeder. Aan elk putje worden 25 μL 1:1.000 verdunde fosfo-4E-BP1-antilichamen in TBST met 5% mageremelk toegevoegd en 1 uur bij RT geïncubeerd. De platen worden één keer gewassen met TBST en vervolgens wordt 25 μL anti-konijn HRP (1:10.000 verdund) in TBST met 5% mageremelk toegevoegd. De platen worden 1 uur bij RT geïncubeerd en 5 keer gewassen met TBST. Voor detectie van fosfo-4E-BP1 wordt 25 μL chemiluminescente reagentia A+B toegevoegd en wordt chemiluminescentie gemeten met behulp van een Analyst plaatlezer.

• Cellijnen

  U937, KG-1, KBM-3B, ML-1, HL-60, and MEG-01

• Concentraties

  0-10 μM

• Incubatietijd

  72 hours

• Methode

  Inhibition of proliferation is measured using the Cell Titer Glo Assay , as noted in figure legends. To generate dose–response curves, cell lines are seeded at a density of 5,000 cells per well in a 96-well plate. After 24 hours of plating, cells are dosed with varying concentrations of either OSI-027 or this compound. The signal for Cell Titer Glo Assay is determined 72 hours after dosing and normalized to that of vehicle-treated controls. Inhibition of proliferation, relative to vehicle-treated controls, is expressed as a fraction of 1 and graphed using PRISM software.

• Dierlijke modellen

  GEO colorectal cells are injected s.c. into the right flank of nu/nu CD-1 mice.

• Doseringen

  ≤65 mg/kg

• Toediening

  Administered via gavage.