Nutlin-3

Nutlin-3 remt potent de MDM2-p53 interactie, wat leidt tot activering van de p53-route. Deze behandeling met de verbinding induceert de expressie van MDM2 en p21, en vertoont een krachtige antiproliferatieve activiteit met een IC50 van ~1,5 µM, uitsluitend in cellen met wild-type p53 zoals HCT116, RKO en SJSA-1, maar niet in de mutante p53-cellijnen SW480 en MDA-MB-435. In SJSA-1-cellen induceert deze verbindingbehandeling bij 10 µM gedurende 48 uur significant caspase-afhankelijke Apoptosis met ~45%. Hoewel het ook de groei en levensvatbaarheid van menselijke huid (1043SK) en muizenembryo (NIH/3T3) remt met een IC50 van respectievelijk 2,2 µM en 1,3 µM, blijven cellen 1 week na behandeling levensvatbaar, zelfs bij 10 µM van deze chemische stof, in tegenstelling tot de SJSA-1-cellen waarbij de levensvatbaarheid verloren ging bij 3 µM van deze chemische behandeling. [1] Het induceert de fosforylering van p53 op belangrijke serineresiduen niet en vertoont geen verschil in hun sequentie-specifieke DNA-binding en het vermogen om p53-doelgenen te transactiveren vergeleken met gefosforyleerd p53 geïnduceerd door de genotoxische geneesmiddelen doxorubicine, wat aantoont dat fosforylering van p53 op belangrijke serines niet essentieel is voor transcriptionele activering en Apoptosis. [2] Hoewel het minder efficiënt bindt aan MDMX dan aan MDM2, kan deze verbinding de MDMX–p53 interactie blokkeren en de p53-route induceren in retinoblastoomcellen (Weri1) met een IC50 van 0,7 µM. [3] Deze chemische stof bij 30 µM verstoort ook de endogene p73-HDM2 interactie en verhoogt de stabiliteit en pro- Apoptosis activiteiten van p73, wat leidt tot dosisafhankelijke celgroeiremming en Apoptosis-inductie in cellen zonder wild-type p53. [4]

Orale toediening van Nutlin-3 bij 200 mg/kg tweemaal daags gedurende 3 weken remt de tumorgroei van SJAS-1 xenografts significant met 90%, vergelijkbaar met het effect van doxorubicinebehandeling met 81% remming van de tumorgroei. [1]

• Biacore-studie

  Competitie assay wordt uitgevoerd op een Biacore S51. Een Series S Sensorchip CM5 wordt gebruikt voor de immobilisatie van een PentaHis-antilichaam voor de opvang van het His-getagde p53. Het opvagniveau is ~200 respons eenheden (1 respons eenheid komt overeen met 1 pg eiwit per mm²). De concentratie van MDM2-eiwit wordt constant gehouden op 300 nM. Nutlin-3 wordt opgelost in DMSO bij 10 mM en verder verdund om een concentratieserie van deze verbinding in elk MDM2-testmonster te maken. De assay wordt uitgevoerd bij 25 °C in loopbuffer (10 mM Hepes, 0,15 M NaCl, 2% DMSO). MDM2-p53 binding in aanwezigheid van deze chemische stof wordt berekend als een percentage van de binding in afwezigheid ervan en de IC50 wordt berekend

• Cellijnen

  HCT116, RKO, SJSA-1, SW480, and MDA-MB-435

• Concentraties

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~ 30 μM

• Incubatietijd

  8, 24, and 48 hours

• Methode

  Cells are exposed to various concentrations of Nutlin-3 for 8, 24 and 48 hours. The transcriptional levels of p21 and MDM2 genes are analyzed by real-time PCR, and protein levels by western blotting. Cell viability is measured by the MTT assay. Cell apoptosis is determined by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end labeling (TUNEL) staining with flow cytometry and fluorescence microscopy.

• Dierlijke modellen

  Athymic female nude mice (Nu/Nu-nuBR) injected subcutaneously with SJSA-1 cells

• Doseringen

  200 mg/kg

• Toediening

  Orally, twice a day