Zosuquidar 3HCl

LY335979 remt competitief de evenwichtsbinding van Pgp door [³H]azidopine-fotoaffiniteitslabeling van de Pgp in CEM/VLB₁₀₀ plasmamembranen te blokkeren. [1] LY335979 alleen vertoont cytotoxiciteit tegen medicijngevoelige en MDR-cellijnen met IC50 variërend van 6 μM-16 μM en produceert het vermogen om de resistentie van oncolytica tegen de MDR-cellijnen P388/ADR, MCF7/ADR, 2780AD of UCLA-P3.003VLB volledig om te keren bij concentraties van 0,1 en 0,5 μM. [1] LY335979 herstelt de medicijngevoeligheid significant in P-gp-expresserende leukemie-cellijnen, waaronder K562/HHT40, K562/HHT90, K562/DOX en HL60/DNR, en versterkt de cytotoxiciteit van anthracyclines en ozogamicine (Mylotarg) in primaire AML-blasten met actieve P-gp. [2] Een recent artikel geeft aan dat LY335979 het apicaal gerichte transport van (Z)-endoxifeen in de ABCB1-getransduceerde cellen volledig remt. [3]

• ATPase-test

  P-Glycoproteïne ATPase-activiteit wordt gemeten door de afgifte van anorganisch fosfaat uit ATP. De test wordt gedurende 90 minuten bij 37 °C in een 96-well plaat gemeten. Membranen (8 μg-10 μg eiwit) worden geïncubeerd in een totaal volume van 100 μL buffer A dat 5 mM natriumazide, 1 mM ouabaïne, 1 mM EGTA, 3 mM ATP, een ATP-regenererend systeem bestaande uit 5 mM fosfoenolpyruvaat en 3,6 eenheden/mL pyruvaatkinase bevat, in aanwezigheid en afwezigheid van 1 mM natriumvanadaat. Pgp-ATPase-activiteit wordt gedefinieerd als het vanadaat-gevoelige deel van de totale ATPase-activiteit. Platen worden 3 minuten na toevoeging van de detectieoplossing afgelezen. De extinctie wordt gemeten bij 690 nm met een microtiterplaatlezer. Een fosfaatstandaardcurve wordt gebruikt om de μmol gevormd fosfaat te berekenen. Monsters worden in drievoud gemeten.

• Cellijnen

  CEM/VLB₁₀₀, P388/ADR, MCF7/ADR, 2780AD, and UCLA-P3.OO3VLB cells

• Concentraties

  0.05 μM to 5 μM

• Incubatietijd

  72 hours

• Methode

  Cell viability is determined using a modified the MTT dye reduction method. Cells are harvested during logarithmic growth phase, and seeded in 96-well plates. The cells are then cultured for 72 hours in the presence of oncolytics with or without modulators. MCF-7 and MCF-7/ADR cells are incubated 24 hours before the addition of the drug with and without the LY335979. LY335979 is prepared as 2 mM DMSO stocks and added to wells to give final concentrations ranging from 0.05 to 5 μM. After 72 hours, 20 μL of freshly prepared MTT(5 mg/mL in Dulbecco's PBS) is added to each well and incubated for 4 hours in a 37 °C incubator containing 5% CO₂. Cells are pelleted in a Sorvall RT6000B centrifuge, 70 μL of medium is carefully removed from each well, and 100 μL of 2-propanol/0.04 N HC1 is added. Cells are resuspended 5-10 times with a Multipipettor or until no particulate matter is visible. Plates are immediately read on a Titertek Multiskan MCC/340 microplate reader Flow Laboratories with a test wavelength of 570 nm and a reference wavelength of 630 nm. Controls are measured in quadruplicate and modulators are measured in duplicate. Cytotoxicity analyses are also performed using the CeliTiter 96 AQueous assay kit.

• Dierlijke modellen

  P388 or P388/ADR cells are implanted by i.p. injection into female BDF₁ mice.

• Doseringen

  ≤30 mg/kg

• Toediening

  Administered via i.p. and i.v.