Ispinesib (SB-715992)

Ispinesib (SB-715992) is een potente, allosterische, reversibele en specifieke remmer van KSP, die de bindingseigenschap van KSP aan microtubuli verandert en de beweging ervan verstoort door de ADP-afgifte te remmen zonder de afgifte van het KSP-ADP-complex van de microtubulus te veranderen. [1] Deze verbinding vertoont potente cytotoxische activiteit in een panel van tumorcellijnen, waaronder Colo205, Colo201, HT-29, M5076, Madison-109 en MX-1, met IC50 van 1,2 nM tot 9,5 nM. [2] In PC-3 prostaatkankercellen (15 nM en 30 nM) blokkeert het celproliferatie en induceert het apoptose door de expressieniveaus van genen te reguleren die apoptose, celproliferatie, celcyclus en celsignalering controleren, zoals EGFR, p27, p15 en IL-11. [3] In een panel van 53 borstcellijnen toont Ispinesib (7,4 nM–600 nM) een brede remmende activiteit. In BT-474 en MDA-MB-468 cellen (150 nM) induceert het apoptose, zoals blijkt uit een hoger percentage apoptotische cellen, een lager anti-apoptotisch Bcl-X_L-niveau en hogere pro-apoptotische Bax- en Bid-niveaus. [4]

Ispinesib (SB-715992) (4,5 mg/kg–15 mg/kg) vertoont remmende effecten tegen Colo205, Colo201, HT-29, maar niet tegen MX-1-cellen, in muis xenograft modellen. Deze verbinding (6 mg/kg–10 mg/kg) remt ook murine solide tumoren, waaronder Madison 109 longcarcinoom, M5076 sarcoom, evenals L1210 en P388 leukemieën. [2] In muis xenograft modellen van borstkankercellen MCF-7, HCC1954, MDA-MB-468 en KPL4, remt het (8 mg/kg–10 mg/kg) de tumorgroei. [4]

• Steady-State Kinetische Analyse van Menselijke KSP ATPase Activiteit en Remming door Ispinesib

  Kinesin-specificiteitsanalyse wordt uitgevoerd met behulp van een pyruvaatkinase-lactaatdehydrogenase detectiesysteem dat de productie van ADP koppelt aan de oxidatie van NADH. Absorbantieveranderingen worden gemonitord bij 340 nm. Steady-state studies met nanomolaire concentraties van KSP worden uitgevoerd met behulp van een gevoelige fluorescentie-gebaseerde assay die gebruik maakt van een pyruvaatkinase, pyruvaatoxidase en mierikswortelperoxidase (HRP) gekoppeld detectiesysteem dat de generatie van ADP koppelt aan de oxidatie van Amplex Red tot fluorescerend resorufin. De generatie van resorufin wordt gemonitord door fluorescentie (λ_excitatie = 520 nm en λ_emissie = 580 nm). Steady-state biochemische experimenten worden uitgevoerd in PEM25-buffer [25 mM Pipes-K⁺ (pH 6,8), 2 mM MgCl₂, 1 mM EGTA] voor experimenten met microtubuli. De IC50 voor steady-state remming wordt bepaald bij 500 µM ATP, 5 µM Microtubuli en 1 nM KSP in PEM25-buffer. K_{i app} (schijnbare remmerdissociatieconstante) waarden van Ispinesib (SB-715992) worden geëxtraheerd uit de dosis-respons curve, met expliciete correctie voor enzymconcentratie door gebruik te maken van de Morrison-vergelijking. De remmer-modaliteit (bijv. competitief, niet-competitief, uncompetitief of gemengd) onder steady-state omstandigheden wordt bepaald door het effect van de concentratie op de initiële snelheid te meten als functie van substraatconcentraties. Gegevens worden gefit met behulp van vergelijkingen in GraFit aan snelheidsvergelijkingen voor de verschillende remmingsmodi.

• Cellijnen

  Breast cancer cells, including MCF-7, HCC1954, MDA-MB-468, and KPL4

• Concentraties

  0.085 nM–33 µM

• Incubatietijd

  72 hours

• Methode

  After plating cells in log phase of growth in 96-well plates and treating them with Ispinesib (SB-715992) for 72 hours, cell growth is measured using CellTiter-Glo, and luminescence is detected using BioTek FLx800. Data are analyzed and the IC50 value, defined as the drug concentration that results in 50% growth inhibition relative to control, is calculated.

• Dierlijke modellen

  Nude (nu/nu) mice models of MCF7, KPL4, and HCC1954 cells; severe combined immunodeficient (SCID) mice model of MDA-MB-468 cells;

• Doseringen

  10 mg/kg for nude mice or 8 mg/kg for SCID mice

• Toediening

  Intraperitoneal injection on a q4d× schedule (3 doses, every 4 day