Enzastaurin

Toepassing van Enzastaurin resulteert in een duidelijke dosisafhankelijke groeiremming in alle onderzochte MM-cellijnen, waaronder MM.1S, MM.1R, RPMI 8226 (RPMI), RPMI-Dox40 (Dox40), NCI-H929, KMS-11, OPM-2 en U266, met IC50-waarden van 0,6-1,6 μM. Deze verbinding heeft directe invloed op humane tumorcellen, induceert apoptose en onderdrukt proliferatie in gekweekte tumorcellen. Het onderdrukt ook de fosforylering van GSK3β^ser9, ribosomaal proteïne S6S240/244 en AKTThr308, terwijl het geen direct effect heeft op VEGFR-fosforylering. [1] Deze chemische stof verhoogt apoptose in maligne lymfocyten van CTCL. In combinatie met GSK3-remmers toonde het een versterking van cytotoxiciteitsniveaus aan. Behandeling met een combinatie van deze verbinding en de GSK3-remmer AR-A014418 leidde tot verhoogde niveaus van β-catenine totaal eiwit en β-catenine-gemedieerde transcriptie. Blokkeren van β-catenine-gemedieerde transcriptie of kleine hairpin RNA (shRNA) knockdown van β-catenine induceerde dezelfde cytotoxische effecten als die van dit plus AR-A014418. Bovendien verminderde behandeling met dit en AR-A014418 de mRNA-niveaus en oppervlakte-expressie van CD44. [2]

Behandeling van xenografts met Enzastaurin en straling produceerde grotere reducties in de dichtheid van microvaten dan elke behandeling afzonderlijk. De afname in microvatdichtheid kwam overeen met vertraagde tumorgroei. [3]

• Kinase-remmingsassays

  De remming van de PKCβII-, PKCα-, PKCε- of PKCγ-activiteit door Enzastaurin wordt bepaald met behulp van een filterplaatassayformaat dat de ³³P-incorporatie in myeline basisch proteïnesubstraat meet. Reacties worden uitgevoerd in reactievolumes van 100 μL in 96-well polystyreenplaten met de volgende uiteindelijke condities: 90 mM HEPES (pH 7,5), 0,001% Triton X-100, 4% DMSO, 5 mM MgCl₂, 100 μM CaCl₂, 0,1 mg/mL fosfatidylserine, 5 μg/mL diacetylglycerol, 30 μM ATP, 0,005 μCi/μL ³³ATP, 0,25 mg/mL myeline basisch proteïne, seriële verdunningen van deze verbinding (1-2.000 nM) en recombinante humane PKCβII-, PKCα-, PKCε- of PKCγ-enzymen (respectievelijk 390, 169, 719 of 128 pM). De reacties worden gestart door toevoeging van het enzym en 60 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Vervolgens worden ze afgeblust met 10% H₃PO₄, overgebracht naar multiscreen anionische fosfocellulose 96-well filterplaten, 30 tot 90 minuten geïncubeerd, gefilterd en gewassen met 4 volumes 0,5% H₃PO₄ op een vacuümverdeelstuk. Scintillatiecocktail wordt toegevoegd en platen worden gelezen op een Microbeta scintillatieteller. IC50-waarden worden bepaald door een logistische vergelijking met drie variabelen te passen aan de 10-punts dosis-responscurve met behulp van ActivityBase 4.0.

• Cellijnen

  HCT116 and U87MG cells

• Concentraties

  0.3-4 μM

• Incubatietijd

  72 hours

• Methode

  Induction of apoptosis by enzastaurin is measured by nucleosomal fragmentation and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick-end labeling (TUNEL) and staining in HCT116 and U87MG cell lines. Briefly, 5 × 10³ cells are plated per well in 96-well plates (1% FBS-supplemented media conditions), incubated with or without this compound for 48 to 72 hours. The absorbance values are normalized to those from control-treated cells to derive a nucleosomal enrichment factor at all concentrations as per the manufacturer's protocol. The concentrations studied ranges from 0.1 to 10 μM. In situ TUNEL staining is assayed with the In situ Cell Death Detection. Cells (7.5 ?10⁴) are plated per well in 6-well plates and incubated 72 hours in 1% FBS-supplemented media ?this chemical. labeled DNA strand breaks are detected with the BD epics flow cytometer. Ten thousand, single-cell, FITC-staining events are collected for each test.

• Dierlijke modellen

  Athymic nude mice; Mouse besring human MM tumors

• Doseringen

  75 mg/kg twice daily; 30 mg/kg twice daily

• Toediening

  By gavage