CP-724714

CP-724,714 is selectief werkzaam tegen EGFR met een IC50 van 6,4 μM. CP-724,714 is >1.000-voudig minder potent voor IR, IGF-1R, PDGFRβ, VGFR2, abl. Src, c-Met c-jun NH2-terminale kinase (JNK)-2, JNK-3, ZAP-70, cycline-afhankelijke kinase (CDK)-2 en CDK-5. CP-724,714 vermindert potent de EGF-geïnduceerde autofosforylering van de chimaera die het erbB2-kinasedomein bevat met een IC50 van 32 nM, maar is aanzienlijk minder potent tegen EGFR in getransfecteerde NIH3T3-cellen. CP-724,714 remt gevoelig de proliferatie van erbB2-geamplificeerde cellen, waaronder BT-474 en SKBR3, met een IC50 van 0,25 en 0,95 μM. CP-724,714 induceert de accumulatie van cellen in de G1-fase en een duidelijke vermindering in de S-fase in BT-474-cellen bij 1 μM. [1] CP-724,714 oefent waarschijnlijk zijn hepatotoxiciteit uit via zowel hepatocellulaire schade als hepatobiliaire cholestatische mechanismen. CP-724,714 vertoont remming van cholyl-lysyl- en taurocholaat (TC)-efflux in canaliculi in respectievelijk cryopreserved en vers gekweekte menselijke hepatocyten. CP-724,714 remt TC-transport in membraanvesikels die de menselijke galzoutexportpomp tot expressie brengen met een IC50 van 16 μM en remt de belangrijkste efflux-transporter in galcanaliculi, MDR1, met een IC50 van ~28 μM. [2]

CP-724,714 (25 mg/kg) wordt snel geabsorbeerd na p.o. toediening en veroorzaakt een vermindering van de tumor erbB2-receptorphosphorylering na dosering in FRE-erbB2 of BT-474 xenografts. CP-724,714 induceert apoptose in FRE-erbB2 xenograft–dragende (s.c.) muizen en vertoont 50% tumorgeremdheid bij 50 mg/kg, zonder gewichtsverlies of mortaliteit. CP-724,714 heeft ook een grote antitumoractiviteit in MDA-MB-453, MDA-MB-231, LoVo (colon) en Colo-205 (colon) xenografts. Bovendien vermindert CP-724,714 (30 of 100 mg/kg) de extracellulaire signaal–gereguleerde kinase- en Akt-fosforylering in BT-474 xenografts. [1]

• Kinase assays

  Recombinante erbB2 (aminozuurresiduen 675-1255) en EGFR (aminozuurresiduen 668-1211) intracellulaire domeinen worden tot expressie gebracht in met baculovirus geïnfecteerde Sf9-cellen als S-transferase fusie-eiwitten. De eiwitten worden gezuiverd door affiniteitschromatografie op Sepharose-kralen voor gebruik in de assay. Nunc MaxiSorp 96-well platen worden gecoat door overnachting bij 37 °C te incuberen met 100 μL/well van 0,25 mg/mL poly(Glu:Tyr, 4:1), PGT in PBS. Overtollig PGT wordt verwijderd door aspiratie en de plaat wordt 3 keer gewassen met wasbuffer (0,1% Tween 20 in PBS). De kinasereactie wordt uitgevoerd in 50 μL van 50 mm HEPES (pH 7,4) dat 125 mm natriumchloride, 0,1 mm natriumorthovanadaat, 1 mm ATP en ~15 ng recombinant eiwit bevat. Remmers in DMSO worden toegevoegd; de uiteindelijke DMSO-concentratie is 2,5%. Fosforylering wordt geïnitieerd door toevoeging van ATP en gedurende 6 min bij kamertemperatuur, met constant schudden, voortgezet. De kinasereactie wordt beëindigd door aspiratie van het reactiemengsel en vier keer wassen met wasbuffer. Gefosforyleerd PGT wordt gemeten na een incubatie van 25 min met 50 μL/well HRP-geconjugeerde PY54-antifosfotyrosine-antilichaam, verdund tot 0,2 μg/mL in blokkeringsbuffer (3% BSA, 0,05% Tween 20 in PBS). Antilichaam wordt verwijderd door aspiratie en de plaat wordt vier keer gewassen met wasbuffer. Het colorimetrische signaal wordt ontwikkeld door toevoeging van 50 μL/well tetramethylbenzidine Microwell Peroxidase Substrate en gestopt door de toevoeging van 50 μL/well 0,09 M zwavelzuur. Het gevormde fosfotyrosineproduct wordt geschat door meting van de absorptie bij 450 nm. Het signaal voor controles is typisch A0,6–1,2, met in wezen geen achtergrond in wells zonder ATP, kinase-eiwit of PGT, en is proportioneel aan de incubatietijd gedurende 6 min.

• Cellijnen

  ZR-75-30, HCC-1419, MDA-MB-175, BT-474, SKBR3, MDA-MB-361, UACC-812, T-47D, MDA-MB-453, MDA-MB-468, CAMA-1, MDA-MB-157, MCF-7, MDA-MB-435, ZR-75-1, BT-20, and MDA-MB-231.

• Concentraties

  0.1 nM - 10 μM.

• Incubatietijd

  6 to 7 days.

• Methode

  Cells are seeded in duplicate at 5~10 × 10³ per well in 24-well plates. The day after plating, CP-724,714 is added by titrating over six or more dilutions from 0.1 nM to 10 μM. Control wells without CP-724,714 are seeded as well. Cells are grown for 6 to 7 days, at which time surviving cells are counted. After trypsinization, cells are placed in isotone solution and counted immediately using a Coulter Z2 particle counter. Growth inhibition is calculated [(1− experimental value / control value) × 100] for each concentration. Dose-response curves are repeated at least twice and averaged. IC50 values are calculated using Calcusyn Software.

• Dierlijke modellen

  FRE-erbB2 BT-474, MDA-MB-453, MDA-MB-231, LoVo (colon), and Colo-205 (colon) xenografts are established in athymic female mice (CD-1 nu/nu).

• Doseringen

  ~100 mg/kg.

• Toediening

  Administered via p.o.