Dovitinib (TKI-258)

Dovitinib (TKI-258) remt krachtig de FGF-gestimuleerde groei van WT- en F384L-FGFR3-expresserende B9-cellen met een IC50 van 25 nM. Bovendien remt het de proliferatie van B9-cellen die elk van de verschillende geactiveerde mutanten van FGFR3 tot expressie brengen. Interessant is dat er minimale verschillen worden waargenomen in de gevoeligheid van de verschillende FGFR3-mutaties voor deze verbinding, waarbij de IC50 varieert van 70 tot 90 nM voor elk van de verschillende mutaties. IL-6-afhankelijke B9-cellen die alleen vector bevatten (B9-MINV-cellen) zijn resistent tegen de remmende activiteit bij concentraties tot 1 µM. Het remt de celproliferatie van KMS11 (FGFR3-Y373C), OPM2 (FGFR3-K650E) en KMS18 (FGFR3-G384D) cellen met een IC50 van respectievelijk 90 nM (KMS11 en OPM2) en 550 nM. De verbinding remt FGF-gemedieerde ERK1/2-fosforylatie en induceert cytotoxiciteit in FGFR3-expresserende primaire MM-cellen. BMSCs verlenen een bescheiden mate van resistentie met 44,6% groeiremming voor cellen behandeld met 500 nM Dovitinib en gekweekt op stroma, vergeleken met 71,6% groeiremming voor cellen gekweekt zonder BMSCs. Het remt de proliferatie van M-NFS-60, een M-CSF-groeigedreven myeloblastische muizencellijn met een mediane effectieve concentratie (EC50) van 220 nM. [1] Behandeling van SK-HEP1-cellen met deze verbinding resulteert in een dosisafhankelijke reductie in celgetal en G2/M-fasearrest met reductie in de G0/G1- en S-fasen, remming van verankeringonafhankelijke groei en blokkade van bFGF-geïnduceerde celmotiliteit. De IC50 hiervoor in SK-HEP1-cellen is ongeveer 1,7 µM. Het vermindert ook significant de basale fosforyleringsniveaus van FGFR-1, FGFR-substraat 2α (FRS2-α) en ERK1/2, maar niet Akt, in zowel SK-HEP1- als 21-0208-cellen. In 21-0208 HCC-cellen remt het significant de bFGF-geïnduceerde fosforylering van FGFR-1, FRS2-α, ERK1/2, maar niet Akt. [2]

Dovitinib (TKI-258) induceert in vivo zowel cytostatische als cytotoxische reacties, resulterend in regressie van FGFR3-expresserende tumoren.[1] Het vertoont een dosis- en blootstellingsafhankelijke remming van doelreceptortyrosinekinases (RTK's) die tot expressie komen in tumorxenografts. Deze verbinding remt krachtig de tumorgroei van zes HCC-lijnen. Remming van Angiogenesis correleerde met inactivatie van FGFR/PDGFRβ/VEGFR2-signaalroutes. In een orthotoop model remt het krachtig de primaire tumorgroei en longmetastase en verlengt het de overleving van muizen significant. [2] Toediening van Dovitinib resulteert in significante tumorgroeiremming en tumorregressies, inclusief grote, gevestigde tumoren (500-1.000 mm³). [3]

• In vitro kinase assays

  De remmende concentratie van 50% (IC50) waarden voor de remming van RTK's door Dovitinib (TKI-258) worden bepaald in een tijdopgeloste fluorescentie (TRF) of radioactief formaat, waarbij de remming van de fosfaatoordracht naar een substraat door het respectievelijke enzym wordt gemeten. De kinase-domeinen van FGFR3, FGFR1, PDGFRβ en VEGFR1-3 worden getest in 50 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethaansulfonzuur), pH 7.0, 2 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂, 1 mM NaF, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mg/mL bovine serumalbumine (BSA), 0,25 μM gebiotinyleerd peptidesubstraat (GGGGQDGKDYIVLPI) en 1 tot 30 μM adenosine trifosfaat (ATP) afhankelijk van de K_m voor het respectievelijke enzym. ATP-concentraties liggen op of net onder de K_m. Voor c-KIT- en FLT3-reacties wordt de pH verhoogd tot 7.5 met 0,2 tot 8 μM ATP in aanwezigheid van 0,25 tot 1 μM gebiotinyleerd peptidesubstraat (GGLFDDPSYVNVQNL). Reacties worden 1 tot 4 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd en het gefosforyleerde peptide wordt op streptavidine-gecoate microtiterplaten met stopreactiebuffer (25 mM EDTA [ethyleendiaminetetraazijnzuur], 50 mM HEPES, pH 7.5) vastgelegd. Gefosforyleerd peptide wordt gemeten met het DELFIA TRF-systeem met behulp van een europium-gelabeld antifosfotyrosine-antilichaam PT66. De concentratie van deze verbinding voor IC50 wordt berekend met behulp van niet-lineaire regressie met XL-Fit data-analyse software versie 4.1 (IDBS). Remming van colony-stimulating factor-1 receptor (CSF-1R), PDGFRα, insulin receptor (InsR) en insulin-like growth factor receptor 1 (IGFR1) kinase-activiteit wordt bepaald bij ATP-concentraties dicht bij de K_m voor ATP.

• Cellijnen

  B9 cells, MM cell lines

• Concentraties

  100 nM

• Incubatietijd

  48-96 hours

• Methode

  Cell viability is assessed by 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyl tetrazolium (MTT) dye absorbance. Cells are seeded in 96-well plates at a density of 5 × 10³ (B9 cells) or 2 × 10⁴ (MM cell lines) cells per well. Cells are incubated with 30 ng/mL aFGF and 100 μg/mL heparin or 1% IL-6 where indicated and increasing concentrations of Dovitinib (TKI-258). For each concentration of this compound, 10 μL aliquots of drug or DMSO diluted in culture medium is added. To evaluate its effect on growth of MM cells adherent to BMSCs, 10⁴ KMS11 cells are cultured on BMSC-coated 96-well plates in the presence or absence of it. Plates are incubated for 48 to 96 hours. For assessment of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)-mediated growth, 5 × 10³ M-NFS-60 cells/well are incubated with serial dilutions of it with 10 ng/mL M-CSF and without granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). After 72 hours cell viability is determined using Cell Titer-Glo Assay. Each experimental condition is performed in triplicate.

• Dierlijke modellen

  8-week-old female BNX mice bearing KMS11 cells

• Doseringen

  10, 30, or 60 mg/kg

• Toediening

  Gavage